（4）接头或衔接子连接。
（5）凝胶过滤分离 cDNA。
（6）通过核酸探针法或免疫反应法从 cＤNA 文库中分离特异 cDNＡ克隆。
2.人工化学合成法
适于已知的核苷酸序列且校小的 DNＡ片断合成,常用方法有磷酸二酯法、磷
酸三酯法、亚磷酸三酯法、固相合成法、自动化合成法等。
过程：先用以上方法合成基因ＤＮA 不同部位的两条链的寡核苷短片段,再退火
成为两端形成粘性末端的 DNＡ双链片段。然后将这些 DNA 片段按正确的次序进
行退火连接起来形较长的 DＮA 片段,再用连接酶连接成完整的基因.
3.利用 PCR 技术直接扩增目的基因
PCＲ（Polｙmerａse Ｃｈaiｎ Reaｃtiｏn）法，又称为聚合酶链反应或 PCR 扩
增技术,已知待扩增目的基因或 DNＡ片段两侧的序列，根据该序列化学合成聚合
反应必需的双引物，类似于 DNA 的天然复制过程,用 PＣR 法进行扩增，特异地合
成目的 cDNA 链，用于重组、克隆。
二．载体的选择与制备
1．载体的选择（以质粒为例）
⑴载体必须是复制子。
⑵具有合适的筛选标记,便于重组子的筛选。
⑶具备多克隆位点(MCS），便于外源基因插入。
⑷自身分子量较小，拷贝数高。
⑸在宿主细胞内稳定性高。
(6)应具有很强的启动子，能为大肠杆菌的 RNＡ聚合酶所识别
(7)应具有阻遏子，使启动子受到控制,只有当诱导时才能进行转录。
(8)应具有很强的终止子,以便使 RNＡ聚合酶集中力量转录克隆的外源基因，而
不转录其他无关的基因，且所产生的 mRNＡ较为稳定。
(9)所产生的 mRNA 必须具有翻译的起始信号。
2.制备有多种分离质粒的方法，如碱裂解法、煮沸裂解法、层析柱过滤法等.
目前一般使用碱变性法制备质粒 DNA。这个方法主要包括培养收集细菌菌体，
裂解细胞，将质粒 DNA 与染色体 DＮＡ分开及除去蛋白质和 RNA。
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