➢ 使λ—DNA 载体只能在特殊的实验条件下感染裂解宿主细菌,以避免可能出现的污
染现象的发生。
➢ 加装选择标记，便于重组体的检测
７.M13 单链噬菌体 DNA 载体
➢ 过定点诱变技术封闭重复的重要限制性酶切口.
➢ 引入合适的选择性标记基因，如含有启动子、操作子和半乳糖苷酶氨基端编码序列
（ｌａcＺ’）的乳糖操纵子片段（lac）、组氨酸操纵子片段(ｈｉs)以及抗生素抗性
基因等。
➢ 将人工合成的多克隆位点接头片段插在 laｃＺ’标记基因内部,使得含有重组子的
噬菌斑呈白色，而只含有载体 DNA 的混浊噬菌斑呈蓝色。
➢ (4)在多克隆位点接头片段的两侧区域改为统一的 DNA 测序引物序列，使得重组 D
ＮA 分子的单链形式经分离纯化后，可直接进行测序反应。
8. IＩ类限制性内切核酸酶的特点
限制性核酸内切酶( Restriction endonuclｅases）是一类能在特异位点上催化双链 DN
Ａ分子的断裂,产生相应的限制性片段的核酸水解酶.
➢ 识别位点的特异性：每种酶都有其特定的 DNA 识别位点，通常是由４、5 或 6 核苷
酸组成的特定序列(靶序列）.
➢ 识别序列的对称性：靶序列通常具有双重旋转对称的结构，即双链的核苷酸顺序呈
回文结构。
➢ 切割位点的规范性:双链 DNA 被酶切后，分布在两条链上的切割位点旋转对称（可形
成粘性末端或平末端的 DNA 分子）。
同位酶：一部分酶识别相同的序列,但切点不同,这些酶称为同位酶.
同裂酶：识别位点与切割位点均相同的不同来源的酶称为同裂酶
同尾酶（Isoｃanｄamｅrs）:识别位点不同,但切出的 DNA 片段具有相同的末端序列，这
些酶称为同尾酶。
9。甲基化酶
Ⅱ类限制性内切酶有相应甲基化酶伙伴，甲基化酶的识别位点与限制性内切酶相同,并在识
别序列内使某位碱基甲基化，从而封闭该酶切口。甲基化酶在封闭一个限制性内切酶切口的
同时,却产生出另一种酶的切口
➢ 甲基化酶可修饰限制性核酸内切酶识别序列，从而使ＤNA 免受相应的限制性核酸内
切酶的切割。
➢ 甲基化酶的用途就是在必要时可以封闭某一限制性核酸内切酶的酶切位点。
10.DNA 连接酶连接作用的特点：
①DNA 连接酶需要一条ＤNA 链的 3’末端有一个游离的羟基(－OH)，另一条ＤＮA 链的 5’
末端有一个磷酸基（-P)的情况下，只有在这种情况下，才能发挥连接 DＮA 分子的作用.
②只有当３’－OＨ和 5'－Ｐ彼此相邻,并且各自位于与互补链上的互补碱基配对的两个脱
氧核苷酸末端时,DNA 连接酶才能将它们连接成磷酸二酯键。
③DNA 连接酶不能连接两条单链的ＤNA 分子或环化的单链ＤNＡ分子,被连接的 DＮA 链必须
是双螺旋 DNA 分子的一部分。
④ＤNA 连接酶只能封闭双螺旋ＤNＡ上失去一个磷酸二酯键所出现的单链缺口(nick),而不
能封闭双链 DNA 的某一条链上失去一个或数个核苷酸所形成的单链裂口（gap）。
⑤由于在羟基和磷酸基团之间形成磷酸二酯键是一种吸能反应,因此，DＮA 连接酶在进行连
接反应时,还需要提供一种能源分子（NAD＋或 ATP)
11。大肠杆菌 DNＡ聚合酶和 Klenow 大片段各有什么作用?
ＤNＡ聚合酶作用的特点:
➢ 要有底物 4 种 dNTP 为前体催化合成ＤNA。
➢ 接受模板指导。
➢ 需要有引物（3'羟基）的存在。
➢ 不能起始合成新的 DNＡ链.
➢ 催化 dＮＴP 加到生长中的 DＮA 链３’—OH 末端。
➢ 催化 DNA 的合成方向是５’→３’。
