考马斯亮蓝 G-250 法测定蛋白质含量
考马斯亮蓝 G-250 法是一种常用的蛋白质定量方法,通过与蛋白质结合的染料考马斯亮蓝 G-250,测定蛋白质含量。该方法有两个版本:常量法和微量法。本文详细介绍了该方法的实验原理、仪器与试剂、操作步骤、数据处理和思考讨论。
一、实验目的
本实验的目的是了解考马斯亮蓝 G-250 法测定蛋白质含量的原理和操作步骤,掌握该方法的应用和优缺点。
二、实验原理
考马斯亮蓝 G-250 是一种染料,在游离状态下呈棕红色,当与蛋白质结合后呈青蓝色。在一定围,也就是蛋白质含量在 0~1000ug 围,蛋白质-色素结合物在 595nm 下的吸光度与蛋白质含量成正比,所以可用比色法测定。
三、仪器与试剂
仪器包括分析天平、铁架台、大漏斗、洗瓶、烧杯、吸管、胶头滴管、移液枪、离心管、722 型分光光度计、容量瓶、洗耳球、玻璃棒、记号笔等。试剂包括蒸馏水、标准蛋白质溶液、考马斯亮蓝 G-250 染液、样品液等。
四、操作步骤
操作步骤包括制作标准曲线、样品中蛋白质含量测定两个部分。在制作标准曲线时,取 8 支离心管,编号后,按下表参加试剂,盖塞后,将各试管中的溶液纵向倒转混匀,室温静止 5min 后,以管一为空白对照,在 595nm 下比色测定。在样品中蛋白质含量测定时,取两支干净的试管,标号 A、B,分别参加 1ml 待测样品液体和 5ml 考马斯亮蓝染液,将两支试管中的溶液纵向倒转混匀,室温静止 5min 后,测定方法同上,由样品液的吸光度查标准曲线即可求出含量。
五、数据处理
数据处理包括计算蛋白质含量和绘出标准曲线。蛋白质含量的计算公式为:样品中的蛋白质含量〔μg/g 鲜重〕={[查得的蛋白质含量〔μg〕] ×稀释倍数}/ [样品鲜重〔g〕]。
六、考前须知
在实验前需要注意以下几点:(1)如果要求严格,最好在试剂参加后的 5~20min 测定光吸收,因为这段时间颜色是最稳定的。(2)测定中,蛋白-染料复合物会有少量吸附于比色杯壁上,不可使用石英比色皿〔因不易洗去染色〕。(3)假设选择在漩涡器上混合,注意不要太剧烈,以免产生大量气泡而难以消除。
七、思考与讨论
(1)制作标准曲线与测定样品时,为什么要将个试管中溶液纵向倒转混合?答:因为可以使反响充分,并且使整个反响液均一,否那么在比色测定时,结果会有很大的偏差,使标准曲线的制作不标准,后续的测定结果就不可靠。
(2)列举几种常用的蛋白质定量测定的方法,并于考马斯亮蓝染色法相比拟各有何优缺点。答:目前常用的有四种古老的经典方法,即定氮法,双缩尿法〔Biuret 法〕、Folin-酚试剂法〔Lowry 法〕和紫外吸收法。考马斯亮蓝法的突出优点是灵敏度高,据估计比 Lowry 法约高四倍,其最低蛋白质检测量可达 1μg。这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大,蛋白质-染料复合物有更高的消光系数,因而光吸收值随蛋白质浓度增加而增加。