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基于UHPLC⁃QqQ⁃MS对蟾衣中游离氨基酸与总氨基酸的分析.docx
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基于UHPLC⁃QqQ⁃MS对蟾衣中游离氨基酸与总氨基酸的分析.docx
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摘要
为探究蟾衣的营养和药用价值,采用超高效液相色谱串联三重四级杆质谱(UHPLC⁃QqQ⁃ MS)技
术,分析蟾衣中游离氨基酸和总氨基酸的组成及含量。实验结果显示,在蟾衣样品中分析出的游离
氨基 酸有 11 种:天冬氨酸、谷氨酸、赖氨 酸、 γ⁃氨基丁酸、酪氨酸、苏氨酸、脯氨酸、缬氨酸、
亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸;总氨基酸有 18 种:精氨酸、胱氨酸、组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、
丝氨酸、赖氨酸、甘氨酸、苏氨酸、丙氨酸、γ⁃氨基丁酸、酪氨酸、脯氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、亮
氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸;并检出了 17 种氨基酸的含量:谷氨酸含量最高,其次是天冬氨酸,
组氨酸和胱氨酸含量较低。此外,本研究建立的 UHPLC⁃QqQ⁃ MS 技术用于测定上述游离氨基酸
和总氨基酸专属性好,灵敏度高,可检测较低质量浓度的氨基酸。蟾衣的氨基酸种类丰富,药用氨
基酸种类齐全,具有重要的营养价值和药用价值。实验结果可为深入研究蟾衣药材的资源开发利用
提供基础资料。
Abstract
In oder to explore the nutritional and medicinal value of toad coat, the composition
and content of free amino acids and total amino acids in toad coat were anlyzed by
ultra high performance liquid chromatography coupled with triple quadrupole mass
spectrometry (UHPLC⁃ QqQ⁃MS). The results showed that 11 free amino acids
(aspartic acid, glutamate, lysine, γ⁃aminobutyric acid, tyrosine, threonine,
proline, valine, leucine, isoleucine, phenylalanine) and 18 total amino acids
(arginine, cystine, histidine, aspartic acid, glutamate, serine, lysine,
glycine, threonine, alanine, γ⁃aminobutyric acid, tyrosine, proline, valine,
methionine, leucine, isoleucine, phenylalanine) were detected in the toad
coat. The contents of 17 amino acids were detected, and glutamate was the
highest, followed by aspartic acid, while histidine and cystine were lower. In
addition, UHPLC⁃ QqQ⁃ MS technology established in this study has good specificity
and high sensitivity to determine the above free amino acids and total amino acids,
and can detect amino acids with low mass concentration. There are many kinds of
amino acids in toad coat, which have important nutritional and medicinal values.
The results can provide basic data for the further study of the resource development
and utilization of toad coat.
译
关键词
蟾衣; 超高效液相色谱串联三重四极杆质谱; 游离氨基酸; 总氨基酸
Keywords
toad coat; UHPLC⁃QqQ⁃MS; free amino acid; total amino acid
译
0 引 言
蟾衣又名蟾宝、月魄、蟾蜕等,是一种民间动物类药材,来源于蟾蜍科(Bufonidae)动物中华大
蟾蜍( Bufo bufo gargarizans Cantor)或 黑眶蟾蜍(Bufo melanostictus Schneider)自然
脱下的角质衣膜
[ 1,2]
。蟾衣性凉,味辛,有微毒,具有清热解毒、利水消肿、抗癌止痛等多种功效,
可治疗慢性肝病、肺癌、肝癌、糖尿病、慢性气管炎、腹水、疔毒、疮痈等多种疾病
[ 3, 4 ]
。现代
药理学研究其具有强心
[ 5]
、降血糖
[ 6]
、抗肿瘤和增强免疫
[ 7]
等作用并对蟾衣抗肿瘤成分如酯蟾毒
配基、蟾毒灵、华蟾酥毒基等做了较多研究
[ 1,2,8 ]
,蟾衣作为一种蟾蜍蜕皮应富含较多氨基酸蛋白,
然而关于这方面的报道却不多见。因此,应进一步对蟾衣中的氨基酸进行研究。氨基酸作为人体的
必需营养成分,是蛋白质的基本结构单位和参与代谢过程中的重要物质,一般以游离态或结合态广
泛存在于自然界中
[ 9]
。本文应用灵敏度高、分析速度快、特异性强的超高效液相色谱串联三重四
极杆质谱(UHPLC⁃QqQ⁃ MS)技术对蟾衣中的游离氨基酸和总氨基酸进行分析,旨在清晰了解蟾
衣中游离氨基酸和总氨基酸的组成与含量,为蟾衣资源的开发利用提供可靠的实验依据。
1 材料与方法
1.1 仪器、试剂与材料
① Agilent 1290 UHPLC(配有在线脱气机、DEBAA06309 二元泵、DEBAP07937 自动进样器、
DEBAL12966 柱温箱 和 DEBAF04820 二极管阵列检测 器,中国安捷伦有限 公司);Sciex API
4000 三重四级杆质谱(SCIEX 公司);三重四极杆质谱数据采集软件 Analyst® 1.7;三重四极
杆质谱数据分析软件 Peak View 1.2;万分之一天平 ME104、百万分之一天平 XPR2(上海梅特
勒⁃ 托利多国际贸易有限公司 ); SIGMA 3K15 超高 速离心机(上海希格玛高技术 有限公司);
R206 旋转蒸发仪(上海大颜仪器设备有限公司)。
② 亮氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、组氨酸、精氨酸、丝氨
酸、谷氨酸、天冬氨酸、缬氨酸、茶氨酸、胱氨酸、天冬酰胺、丙氨酸、苏氨酸、酪氨酸、γ⁃ 氨基
丁酸、脯氨酸对照品(上海诗丹德标准技术服务有限公司,纯度均≥98.0%);盐酸(分析纯,上
海泰坦科技股份有限公司);乙腈(质谱纯,Merck 公司);水(蒸馏水,广州屈臣氏食品饮料有
限公司北京饮料分公司);甲酸铵(质谱纯,赛默飞世尔科技公司)。
③ 蟾衣购自安徽安远县,经贵州医科大学药学院龙庆德教授鉴定为蟾蜍科动物中华大蟾蜍产的蟾
衣,经处理后并自然干燥。
1.2 方法
1.2.1 对照品储备液的制备
精密称定丙氨酸、脯氨酸各 1.5 mg,精氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、茶氨酸、胱氨酸和谷氨酰胺各 1
mg,均置 10 mL 容量瓶中,记为瓶 1;精密称定 γ⁃ 氨基丁酸 1.5 mg、天冬酰胺、天冬氨酸、谷
氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、酪氨酸、缬氨酸各 1 mg,均置 20 mL 容量瓶中,记为瓶 2;
精密称定苏氨酸 2.5 mg、甘氨酸 2 mg、组氨酸 1 mg,均置于 10 mL 容量瓶中,记为瓶 3;精
密称定蛋氨酸 1 mg,置于 20 mL 容量瓶中,记为瓶 4;向瓶 2、3、4 中加适量 0.1 mol/L 盐酸
溶液溶解后定容至刻度,摇匀,各取 1 mL 均置于瓶 1 中,加 50%乙腈溶液稀释并定容至刻度,
摇匀,即得对照品储备溶液。
1.2.2 供试品溶液的制备
①游离氨基酸定性分析供试品溶液的制备: 精密称定供试品粉末 1 g,置锥形瓶中,加 50 mL 沸
水,水 浴加热 10 min(每 5 min 取出摇 晃), 混匀后 取适量 样品溶 液,15 000 r/min 离心 5
min,取上清液,即得。
②总氨基酸 定 性 分 析 供试品溶液 的 制 备 : 精 密 称 定供试品粉 末 0.5 g, 置 水 解 管 中,加入 6.0
mol/L 盐酸 10 mL,加 3~4 滴苯酚,混匀,充氮气密封,置 110 ℃烘箱中水解 20 h。取出水解
管,冷却至室温,抽滤,取滤液于旋转蒸发仪中浓缩挥干盐酸,用水洗(每次 2 mL)数次至盐酸
彻底挥干,0.1 mol/L 的盐酸定容至 20 mL,混 匀。取适量 4 ℃ 15 000 r/min 离心 5 min,
取上清液 1 mL,于 10 mL 容量瓶中,加 0.1 mol/L 的盐酸稀释并定容至刻度,摇匀,取适量 4 ℃
15 000 r/min 离心 5 min,即得。
③总氨基酸定量分析供试品溶液的制备: 精密称定供试品粉末 0.1 g,平行两份,置水解管中,
加入 6.0 mol/L 盐酸 10 mL,加 3~4 滴苯酚,混匀,充氮气密封,置 110 ℃烘箱中水解 20 h。
取出水解管,冷却至室温,抽滤,取滤液于旋转蒸发仪中浓缩挥干盐酸,用水洗(每次 2 mL)数
次至盐酸彻底挥干,0.1 mol/L 的盐酸定容至 25 mL,混匀。取适量 4 ℃ 15 000 r/min 离心 5
min,取上清液 1 mL,分别置于 25、50 mL 容量瓶中,加 0.1 mol/L 的盐酸稀释并定容至刻度,
摇匀,取适量 4 ℃ 15 000 r/min 离心 5 min,即得。
1.2.3 色谱条件
采用 Agilent Poroshell 120 HILIC⁃Z 色谱 柱( 3.0×100 mm,2.7 μm);柱 温:25 ℃;检
测波长:254 nm;进样量:1 μL;流速:0.8 mL/min;流动相:A 为 2 mmol/mL 甲酸铵⁃水
溶液,B 为 2 mmol/mL 甲酸铵⁃乙腈溶液;洗脱梯度见表 1。
表 1 氨基酸分析流动相洗脱梯度
Table 1 Elution gradient of mobile phase for amino acid analysis
时间
/min
流动相 A/%
流动相 B/%
0
0
100
11.5
30
70
18
50
50
20
0
100
25
0
100
下载: 导出 CSV
1.2.4 质谱条件
电喷雾离子化源(ESI),扫描方式为多反应监测(MRM)模式;正离子模式检测;离子源温度
500°C;离子喷雾电压 5 500 V;雾化气(Gas 1)50 psi;辅助加热气(Gas 2)50 psi;气帘
气 30 psi;氮气作为喷雾辅助气体。在上述仪器条件下测定,各氨基酸的质谱采集参数见表 2。
表 2 化合物多反应监测参数
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