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三代测序原理技术比较.docx
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三代测序技术和原理介绍
导
读
从 年第一代 测序技术〔 法〕,开展至今三十多年时
间,测序技术已取得了相当大的开展,从第一代到第三代乃至第四代,测序
读长从长到短,再从短到长。
摘要:从 年第一代 测序技术〔 法〕,开展至今三十多年时间,
测序技术已取得了相当大的开展,从第一代到第三代乃至第四代,测序读长从长到短,再
从短到长。虽然就当前形势看来第二代短读长测序技术在全球测序市场上仍然占有着绝对
的优势位置,但第三和第四代测序技术也已在这一两年的时间中快速开展着。测序技术的
每一次变革,也都对基因组研究,疾病医疗研究,药物研发,育种等领域产生巨大的推动
作用。在这里我主要对当前的测序技术以与它们的测序原理做一个简单的小结。
图 1:测序技术的开展历程
生命体遗传信息的快速获得对于生命科学的研究有着十分重要的意义。以上〔图 〕
所描述的是自沃森和克里克在 年建立 双螺旋结构以来,整个测序技术的开展历
程。
第一代测序技术
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第一代 测序技术用的是 年由桑格〔〕和考尔森〔〕开创
的链终止法或者是 年由马克西姆〔〕和吉尔伯特〔〕发明的
化学法〔链降解〕并在 年,桑格测定了第一个基因组序列,是噬菌体 ! 的,
全长 个碱基 。自此,人类获得了窥探生命遗传差异本质的能力,并以此为开端步
入基因组学时代。研究人员在 法的多年实践之中不断对其进展改良。在 "## 年,
完成的首个人类基因组图谱就是以改良了的 法为其测序根底, 法核心原
理是:由于 $$%& 的 "'和 '都不含羟基,其在 的合成过程中不能形成磷酸二酯键,
因此可以用来中断 合成反响,在 ! 个 合成反响体系中分别参加一定比例带有放
射性同位素标记的 $$%&〔分为:$$%&($$%&($$%& 和 $$%%&〕,通过凝胶电泳和
放射自显影后可以根据电泳带的位置确定待测分子的 序列〔图 "〕。这个网址为
测序法制作了一个小短片,形象而生动。
值得注意的是,就在测序技术起步开展的这一时期中,除了 法之外还出现了
一些其他的测序技术,如焦磷酸测序法、酶法等。其中,焦磷酸测序法是后来 )*+ 公司
!! 技术所使用的测序方法 ",!,而连接酶测序法是后来 -. 公司 /0. 技术使用的测
序方法 "(!,但他们的共同核心手段都是利用了 中的可中断 合成反响的
$%&。
图 ": 法测序原理
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第二代测序技术
总的说来,第一代测序技术的主要特点是测序读长可达 ###1,准确性高达
2,但其测序本钱高,通量低等方面的缺点,严重影响了其真正大规模的应用。因
而第一代测序技术并不是最理想的测序方法。经过不断的技术开发和改良,以 )*+ 公
司的 !! 技术、 公司的 ,34 技术和 -. 公司的 $ 技术为标记的
第二代测序技术诞生了。第二代测序技术大大降低了测序本钱的同时,还大幅提高了测序
速度,并且保持了高准确性,以前完成一个人类基因组的测序需要 年时间,而使用二代
测序技术那么仅仅需要 周,但在序列读长方面比起第一代测序技术那么要短很多。表
和图 对第一代和第二代测序技术各自的特点以与测序本钱作了一个简单的比拟 ,以下
我将对这三种主要的第二代测序技术的主要原理和特点作一个简单的介绍。
图 测序本钱的变化
Illumine
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"
. 公司的 和 34 应该说是目前全球使用量最大的第二代测序机器,
这两个系列的技术核心原理是一样的 "(!。这两个系列的机器采用的都是边合成边测序的
方法,它的测序过程主要分为以下 ! 步,如图 !
〔1〕DNA 待测文库构建
利用超声波把待测的 样本打断成小片段,目前除了组装之外和一些其他的特殊
要求之外,主要是打断成 "####1 长的序列片段,并在这些小片段的两端添加上不同
的接头,构建出单链 文库。
〔2〕Flowcell
56* 是用于吸附流动 片段的槽道,当文库建好后,这些文库中的 在通
过 76* 的时候会随机附着在 76* 外表的 *+ 上。每个 56* 有 8 个
*+,每个 *+ 的表面都附有很多接头,这些接头能和建库过程中加在 片
段两端的接头相互配对〔这就是为什么 76* 能吸附建库后的 的原因〕,并能支
持 在其外表进展桥式 &) 的扩增。
〔3〕桥式 PCR 扩增与变性
桥式 &) 以 56* 外表所固定的接头为模板,进展桥形扩增,如图 ! 所示。经
过不断的扩增和变性循环,最终每个 片段都将在各自的位置上集中成束,每一个束
都含有单个 模板的很多分拷贝,进展这一过程的目的在于实现将碱基的信号强度放
大,以达到测序所需的信号要求。
〔4〕测序
测序方法采用边合成边测序的方法。向反响体系中同时添加 聚合酶、接头引物
和带有碱基特异荧光标记的 ! 中 $%&〔如同 测序法〕。这些 $%& 的 '/3 被
化学方法所保护,因而每次只能添加一个 $%&。在 $%& 被添加到合成链上后,所有未
使用的游离 $%& 和 聚合酶会被洗脱掉。接着,再参加激发荧光所需的缓冲液,用
激光激发荧光信号,并有光学设备完成荧光信号的记录,最后利用计算机分析将光学信号
转化为测序碱基。这样荧光信号记录完成后,再参加化学试剂淬灭荧光信号并去除 $%&
'/3 保护基团,以便能进展下一轮的测序反响。. 的这种测序技术每次只添加一
个 $%& 的特点能够很好的地解决同聚物长度的准确测量问题,它的主要测序错误来源是
碱基的替换,目前它的测序错误率在 22之间,测序周期以人类基因组重测序为例,
# 测序深度大约为 周。
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huayuya123
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