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荧光探针定量PCR技术原理与应用.doc
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荧光探针定量PCR技术原理与应用.doc
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荧光探针定量 PCR 技术原理与应用 技术是通过对基因的选择性片段进行体外高效扩增,实现目
的基因的检测。荧光探针定量 ()是一种新的基因定量检测技术,国外文献多用“实时定量
()”或“以美国 公司商标命名。该技术是在常规
基础上加入荧光标记探针,巧妙地把核酸扩增()、杂交与光谱技术结合在一起,从而实现了
对目的基因的准确定量检测,正发展成为临床实验诊断的常规技术。
原理 的工作原理是利用 酶的 外切酶活性,在 反应系统中加入一个荧
光标记的探针。该探针可与引物包含序列的 !"# 模板发生特异性杂交,探针的 端标以荧光报告基团
#($羧基荧光素,荧光发射峰值在 % 处),靠近 端标以荧光淬灭基团 ##$羧基四甲
基诺丹明&荧光发射峰值在 %' 处,两者之间构成能量传递结构。当探针保持完整时,端荧光报告
基团所激发出的荧光信号被 端淬灭基因吸收或抑制,不出现荧光信号变化。当 反应体系中有目的
基因存在,就会扩增出特异核酸片段,荧光探针即会根据碱基配对的原理与之杂交。当 进入延伸
(复制)期,( 酶从引物 端开始&随新链延伸沿 !"# 模板移动,当移动到探针结合的位置时,其
端外切酶活性作用,将探针切断(切口平移效应)。荧光报告基团和淬灭基团间的能量传递结构被破坏,
淬灭基团的淬灭作用被解除,荧光报告基团的荧光信号释放出来(图 )。 反应每复制一个特异核酸
片段,就有一个探针被切断,伴随一个荧光信号的释放。由于被释放的荧光基团数目和 产物是一对
一的关系,因此用荧光检测技术检测出的荧光信号有无或强弱,即代表扩增产物有无或多少。由于荧光信
号是代表扩增产物的有效特异信号,无需进行有效和无效信号分离,实现了仪器实时检测图 ',为新的
定量原理创造了条件。
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图 1.TaqMan PCR 反应模式 (A)聚合反应:(B)链置换;(C)裂解; (D)聚合完成(R:
FAM;Q:TAMRA;FP:上游引物;RP:下游引物)
图 2.FQ-PCR 实时动力学曲线 #)* 公司首先根据上述原理研制了 #)*++,,等系列定量 仪,在
反应中设置标准模板系列(一般 -+ 个标准浓度)反应管和空白对照管。通过实时检测反应管中的
荧光信号,计算出 .、、△。.代表样品管荧光报告基团发光强度与淬灭基团发光强度的
比率,代表空白管中二者的比率,△(△/.)代表 过程中荧光信号变化量。
当荧光信号增强到某一阈值(根据荧光信号基线的平均值和标准差,计算出以 00+1的置信度大于平均
值作为阈值)时,标准模板反应管所用的循环次数( 值)就被记录下来。 值与标准模板数量的对数
值之间有严格的线性关系,利用系列标准模板的 值,制成标准曲线图 ,根据待测样品的 值,
就可在标准曲线中确定待测样品起始的 !"# 数量。根据数据处理,即可得出定量结果。探针设计一般应
符合以下条件':①探针长度应在 ',-2, 个碱基左右,以保证结合的特异性。② 3 碱基含量在
2,1-$,1,避免单核苷酸序列的重复。③避免与引物发生杂交或重叠。④探针与模板结合的稳定程度
要大于引物与模板结合的稳定程度,因此探针的 值要比引物的 值至少高出 4。另外,探针的浓
度,探针与模板序列的同源性,探针与引物的距离都对实验结果有影响。
图 3.FQ-PCR 标准曲线
2. 技术特点
2.1 封闭状态下检测,避免了扩增产物污染而致的假阳性
55555传统 于反应结束后取出反应液,通过电泳染色和紫外仪观察结果。扩增产物在开放状态下分析,
对实险室的污染是不可避免的。因污染而导致假阳性,成为 临床实验诊断技术应用一个难以逾越的
障碍。 在全封闭状态下实现 扩增和产物分析,完全杜绝了扩增产物污染而导致的假阳性。
至于样品间的污染,无论从目的基因的数量、浓度还是颗粒大小分析,都比较容易控制。我国 临床
应用出现问题,产物污染所致假阳性是主要原因之一。
2.2 基因的定量检测,扩展了临床应用空间 传统 对基因的检测只能定性,不能定量主要是由扩增
产物积累的动力学所决定的:① 产物在扩增过程中呈指数积累,当产物增加到一定程度,产物就停
止了指数积累。不同起始模板,其指数增长期所用的循环是不同的,因此,不同数量基因的样品在同一循
环次数中积累的产物不能作为样品基因定量的依据;② 产物积累到一定程度就不能再增加,再进入
平台期。为了扩大 检出的灵敏度通常要增加循环次数,循环次数增加使得样品目的基因含量高的反
应管已进入平台期,终产物量并不代表样品目的基因含量;③ 反应的管间扩增效率差异总是存在的,
既然 产物呈指数增长,由扩增效率差异引起的产物扩增差异也呈指数积累,增加循环次数势必增加
终产物的差异,而减少循环次数又降低了检测的灵敏度。 采用实时检测,使所有含有不同数量的
目的基因均在同一条件(达到荧光阈值)下进行分析,因而更具有可比性。而且,这一条件处于扩增产物
指数积累初期,合成产物所需的 6"、酶、离子均处于饱和的最佳状态,所以 循环参数与起始
模板间有良好的线性关系(相关系数>,0),实现了极为精确的基因定量检测。
2.3 光谱技术进一步提高了灵敏度
55555技术已用于单细胞基因诊断,灵敏度已达到极限水平,即检测单拷贝基因,而传统 是不
易做到的。灵敏度提高得益于光谱技术。
2.4 荧光探针杂交,进一步提高了特异性
55555 扩增中常会出现非特异性扩增和引物二聚体,从而影响了对特异电泳带的判断。 通过特
异性探针杂交信号检测 扩增产物,相当于 反应过程中自动完成了 789 杂交,进一步提高
目的基因检测的特异性。
2.5 扩增与自动分析一体化,检测更加简便和快速
通过计算机和分析软件,使 扩增、产物检测和定量分析一体化,比传统定性 更为
简便和快速,同时也避免了传统 产物分析中有害物质对人体的影响,计算和数据处理也有利于科研
和临床资料的保存和分析。
3. 临床应用概要 科学研究已经证明,人类疾病大都直接或间接与基因有关,临床实验医学正进入基因
诊断时代。但对于许多疾病的发生和发展来说,相关基因不是有无问题,而是一个从量变到质变的过程,
基因定量检测更具有临床意义。
3.1 感染性疾病 在医学检验学中最有价值的应用领域就是对感染性疾病的诊断。理论上,只要样
本有一个病原体存在, 就可以检测到。一般实验室也能检出 ,-,' 基因拷贝,而目前病原体抗原
检测方法一般需要 ,+ 个病原体才可检测到。 对病原体的检测解决了免疫学检测的“窗口期”问题,
可判断疾病是否处于隐性或亚临床状态。
55555定量 研究资料已表明,病原体数量与感染性疾病病情的轻重程度、传染性与治疗效果均有相关性。
许多研究表明,人类免疫缺陷病毒:*;感染后,潜伏期长短和临床症状轻重与血液中的病毒量显著相关;
有也研究表明,:*; 病毒载量低于一定值时,没有传染性。
55555在乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒定量研究中发现,病毒的数量与某些药物的疗效相关。例如,干扰素
治疗对肝炎病毒高拷贝者不敏感,低拷贝者敏感;而有些药物则具有显著降低病毒高拷贝的作
用。
3.2 肿瘤 尽管肿瘤发病的分子机制尚未完全清楚,但相关的基因的遗传学改变的积累,是致癌性转变
的根本原因已被普遍接受。
55555癌基因的表达增加和突变,在许多肿瘤早期和良性的阶段就可出现。 技术不但能有效的检测基因
的突变,而且能准确检测癌基因的表达量,可据此进行肿瘤早期诊断、分型、分期和预后判断。
几乎所有慢性骨髓性白血病患者都可检测到原癌基因易位导致的 )<#)= 融合基因形成,定量 技术
可通过检测 )<#)= 融合基因的表达确定微量残余恶性细胞存在的数量,以此作为治疗效果和估计复发
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的危险性的依据。
55555肿瘤标记物质也是肿瘤诊断的热门研究领域。目前临床对此多用免疫学方法检测,灵敏度低,一般需
要达到 ,% 个分子数。用定量逆转录 方法,一般条件下可检出 ,,' 某种标志物的
"#,可大大提高检出率。
55555一些病毒致癌作用也与病毒载量有关,) 病毒载量的 检测结果已被用于鼻咽癌早期发现和
随访。
3.3 遗传病
55555 技术首次临床应用就是从检测镰状细胞和 >地中海贫血的基因突变开始的。基因的突变和缺失均
会引起各种珠蛋白的表达不平衡,用 检测各种珠蛋白基因表达差异,是地中海贫血诊断的有效手
段。
55555总之,除与疾病直接相关的基因检测外,各种与疾病相关的细胞因子、激素、受体,用 方法
检测其基因表达水平具有更高的灵敏性,更有利于疾病诊断。
参考文献
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8((8D6D(86C96(86DGDDHH86CB(86C6
CCC69GI6J8986D#((C&00&2K+$'
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C8(86CIGJB9N8NO8CDCG8H9
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6C88HD(CMC!"#DCD)8C988BG&00'&,K22+
一 荧光探针定量 PCR 定量检测的意义 定量检测与定性检测的最大区别就在于,定性只是检测病原体
核酸的“有”或“无”,而定量可以检测病原体核酸量的“多”或“少”。
55555定量检测的意义:
体现病原体含量与复制水平、感染程度之间的关系。
' 评价和考核治疗效果。
用于传染病发病的监控、预测与预防。
2 作为新的愈后指标。
建立新的病原体分子诊断标准。
$ 新的药物与疗法的研究与开发。
二 荧光定量 PCR 报告结果的读取: 荧光定量 是直接扩增病原体的特异性 !"# 或 C!"#,其结
果反映了标本中 !"# 或 "# 存在的多少,结果通常用数字表示,
55555报告为“C8(D<、“'P<或“C8(D&C8(G 即“拷贝”,表示病原体基因组的个数,该数据越大,
表明病原体在体复制得越厉害,传染性越强。
55555例::);!"#定量结果报告:$+Q,2*P<(如果采用科学记数法表示为:$+.,2),
代表每 血液中含有 $&+, 国际单位乙肝病毒分子。
55555如果待检标本能够定量,如血液等,结果报告为多少 C8(D< 或 'P<。
55555如果待检标本不易定量,如分泌物、痰液等,结果只报告为多少 C8(D。
乙型肝炎病毒(HBV) 一 乙肝病毒(hepatitis B virus, HBV)感染 :); 感染是全球性公共卫生
问题,世界卫生组织统计,全世界乙肝病毒携带者有 亿人之多。我国人群 :); 携带率约为 ,1,有
近 亿人感染 :);,是世界上最大的“肝炎大国”。
:); 感染后临床表现呈多样性,可表现为重症肝炎、急性肝炎、慢性肝炎或无症状携带者,其中部分慢
性肝炎可演变成肝硬化或肝癌。:); 携带者因无症状,不易被察觉,其作为传染源的危害性比患者更甚。
55555:); 病毒颗粒呈球形,具有双层的衣壳,:)D#B 镶嵌于脂质双层的外衣壳中。:)D#B 大量存在于感
染者血中,是 :); 感染的主要标志,可刺激机体产生保护性抗体即 :)D#I。
55555:)C#B 位于衣壳部分,其外被 :)D#B 所覆盖,不易在血循环中检出。其抗原性较强,能刺激机体产
生 :)C#I。:)C#IB3 在血中持续时间较长,为非保护性抗体。:)C#IB 提示 :); 处于复制状态。
55555:)#B 是 基因(前核基因)的编码产物,是一种非结构性蛋白,为可溶性蛋白质,自肝细胞
分泌入血中。:)#B 的消长与病毒体的 !"# 聚合酶的消长一致,故可作为 :); 复制与强感染性的指标。
其刺激机体产生 :)#I,对 :); 感染有一定的保护作用,通常认为 :I#I 的出现是预后良好的征象。
在这三对抗原、抗体系统中,核心抗原较难检测到,一般不作为临床常规检查,故称为“两对半”。其中
:)D#B、:)#B、:)C#I 三项阳性称为“大三阳”, :)D#B、:)#I、:)C#I 三项阳性称为“小三阳”。
二 “两对半”检测与 HBV-DNA 定量 “两对半”是从免疫学水平来检测 :); 感染机体后引起免疫应答,
产生相应抗原抗体的含量(这个“含量”还不是定量,而只是抗原抗体的“有”或“无”),它实际上测定的是机
体感染 :); 后免疫应答结果的反映。由于个体反应的差异,不同的人在感染 :); 后会出现不同的免疫应
答,从而得到不同的“两对半”结果模式。如产生抗体、表现为“携带者”、“大三阳”、“小三阳”等等。但是所
有这些免疫学指标不能反映患者或病人体病毒的复复水平与传染程度,不能提示其与乙型肝炎的发生和发
展过程之间的联系。
55555荧光探针定量 技术则是从分子生物学水平直接检测 :); 病毒自身的遗传物质 !"#,是病毒存在
和复制的最可靠、最直接的指标。
55555:)D#B 虽然是 :); 的感染标志,但在感染的早期,或由于 7 基因(编码 :)D#B)的低水平表达或变
异,常规方法难以检出,会导致漏检。:);!"# 检测比免疫学检测更早期、更灵敏。免疫学方法检测为
:)D#BR的病人中,约有 1以上检测出 :);!"#.&健康供血者用 方法检测 :);!"#,也有
一定比例的阳性。:)D#B 阴性的慢性肝炎中,仍有部分是 :); 感染引起的。所以单凭 :)D#B 阳性与否
来判断肝脏中 :); 的复制与有无传染性是远远不够的,易造成部分慢性型病毒性肝炎的漏诊。对于
:)D#B 阴性或有 :); 感染后的任何血清学依据都应进一步进行 :);!"# 荧光定量检测。也有时出现
:)#BR而 :);!"#.的结果,这是因为编码 抗原的 区基因极易出现变异,在 区出
现终止密码子,使 区基因与 区基因不能转译出完整的 抗原,导致 :)#B 表达缺失,机体感染
:); 不表达 :)#B,当然血清学方法也不能检测出 :)#B 的存在。
55555:)D#B.患者中大约有 ,1检测不出 :);!"#,这种情况在世界各国都有报道。一方面,由于
:);!"# 整合于宿主细胞基因组,或基因变异,与常用的 引物、探针不匹配, 扩增不出相应
的基因序列,因而未能检出。此外,由于 :); 的复制有反转录过程,7 基因(编码表面抗原)可以以
'?I"# 为 "# 转译成 :)D#B,故在部分 :); 感染中虽无病毒复制,但可长期产生 :ID#B。~
,1:); 感染者表现为单项 :)C#I 阳性。有许多报道证明,单项 :)C#I 阳性的血液可以引起 :); 的
输血后感染。如果同时检查 :);!"#,可以减少漏检,预防输血后肝炎的发生。
55555应用 检测发现,大多数“大三阳”病人血中能够检出 :);!#"(检出率约为 0$1左右),有相当
一部分人 抗原转化 抗体后,即“大三阳”转化为“小三阳”后,其血清中仍有 !"# 存在检出率约为
,1,说明病毒仍未消失和停止复制。“小三阳”病人血清中 :);!"# 转阴率约为 $,+,1,这与病毒
遗传物质突变或与宿主基因组整合、用药后复制暂停、以与血清 :); 病毒炎症清除使血清中的 :);
!"# 消失或下降至极低浓度(低于检测下限)有关,这种情况下并不表示病人恢复,应随访并复查血清
:);!"# 以免误症。
55555要特别指出的是,近年来由于抑制病毒复制的核苷类药物药物(如拉咪呋啶)在临床的大量使用,使
得 :);!"# 复制水平可能会在短时期迅速降低至不可检测水平(这时候免疫学检测指标可不发生改变),
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