CLONTECH酵母双杂中文版.doc

【酵母双杂交系统简介】 酵母双杂交是一种强大的分子生物学技术，用于研究在活细胞中蛋白质之间的相互作用。CLONTECH的BD Matchmaker系统是该技术的一个广泛应用平台，它允许研究人员通过在酵母细胞内模拟哺乳动物细胞内的蛋白质-蛋白质或蛋白质-DNA相互作用来识别和验证潜在的相互作用。 【酵母菌株和载体】 BD Matchmaker系统包括两种主要的酵母菌株AH109和Y187，它们分别带有不同的报告基因，如His3、Ade2和Leu2，用于检测和筛选相互作用。同时，系统提供了多种酵母载体，如BD和AD系列载体，用于构建DNA-BD融合蛋白和AD融合蛋白，以进行蛋白质相互作用的研究。 【文库构建与筛选】 1. **单杂交文库构建**：利用BD SMART cDNA合成技术从组织RNA中合成双链cDNA，然后将目的片段克隆到BD载体中，构建含有目标蛋白的DNA-BD融合表达文库。 2. **双杂交文库构建**：对于蛋白质-蛋白质相互作用，需要构建AD融合文库。这通常涉及PCR扩增感兴趣的cDNA片段，然后将其插入AD载体中。 【筛选过程】 - **酵母配对筛选**：通过将含有BD融合蛋白的酵母株与含AD融合文库的酵母株进行配对，如果存在相互作用，酵母菌将在缺乏必需营养素的培养基上生长，表明阳性相互作用。 - **共转化筛选**：也可以通过将BD融合载体和AD融合文库共转化到同一酵母菌株中，然后在特定培养基上筛选阳性克隆。 【结果分析与验证】 筛选出的阳性克隆需进一步验证，通常包括PCR、西方印迹或酵母二倍体重组等方法。例如，图12和图13展示了可能的单杂交和双杂交阳性结果的分析策略。 【问题解决指南】 在实验过程中遇到的问题可以通过提供的问题解决指南来解决，如转化效率低、假阳性结果等。 【对照实验】 为了确保实验的可靠性，需要进行对照实验，如图7至图12所示的单杂交和双杂交共转化对照实验设置，以及对应的期望结果。 CLONTECH的酵母双杂交中文版文档详细地介绍了如何使用BD Matchmaker系统进行酵母双杂交和单杂交实验，从文库构建、筛选、结果分析到问题解决，为研究人员提供了全面的操作指导。这一技术在蛋白质功能研究、信号转导途径探索以及药物靶点鉴定等领域具有广泛的应用价值。