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质粒提取原理与步骤 质粒提取是分子克隆中的一种常见技术，用于从细菌中提取质粒 DNA。该过程通常包括三个步骤：细菌培养物的生长、细菌的收获和裂解、质粒 DNA 的纯化。 一、细菌培养物的生长 在质粒提取过程中，首先需要将细菌培养物生长到对数晚期。这一步骤的目的是为了增加质粒的拷贝数，以便于后续的纯化过程。通常情况下，使用的质粒载体（如 pUC 系列）都能复制到很高的拷贝数，因此只需要将培养物放在标准 LB 培养基中生长到对数晚期。 然而，对于较长一代的载体（如 pBR322），需要在得到部分生长的细菌培养物中加入氯霉素继续培养若干小时，以便对质粒进行性扩增。氯霉素可抑制宿主的蛋白质合成，结果阻止了细菌染色体的复制，然而，松弛型质粒仍可继续复制，在若干小时内，其拷贝数持续递增。 二、细菌的收获和裂解 细菌的收获可通过离心来进行，而细菌的裂解则可以采用多种方法中的任意一种，这些方法包括用非离子型或离子型去污剂、有机溶剂或碱进行处理及用加热处理等。选择哪一种方法取决于三个因素：质粒的大小、小肠杆菌菌株及裂解后用于纯化质粒 DNA 的技术。 对于大质粒（大于 15kb），需要采用漫和裂解法从细胞中释放出来。对于小质粒，可以用更剧烈的方法来分离，例如加入 EDTA 后，让细菌暴露于去污剂，通过煮沸或碱处理使之裂解。 三、质粒 DNA 的纯化 常使用的所有纯化方法都利用了质粒 DNA 相对较小及共价闭合环状这样两个性质。例如，用氯化铯－溴化乙锭梯度平衡离心分离质粒和染色体 DNA 就取决于溴化乙锭与线状以及与闭环 DNA 分子的结合量有所不同。 氯化铯－溴化乙锭梯度平衡离心已经成为制备大量质粒 DNA 的首选方法。然而，该过程既昂贵又费时，为此发展了许多替代方法。其中主要包括利用离子交换层析、凝胶过滤层析、分级沉淀等分离质粒 DNA 和宿主 DNA 的方法。 在本实验室中，我们采用离子交换层析法已经可以得到极高纯度的质粒 DNA。