质粒DNA的提取碱裂解法
本文主要介绍了质粒DNA的提取碱裂解法的实验原理、步骤和注意事项。
一、实验原理：
质粒DNA的提取碱裂解法是基于质粒DNA与线状染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它们。在pH值介于12.0-12.5的狭窄范围内，线状的DNA双螺旋结构解开变性，而共价闭合环状质粒DNA的氢键虽然断裂，但两条互补链彼此依然相互盘绕而紧密地结合在一起。当加入pH4.8的醋酸钾高盐缓冲液使pH降低后，共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链迅速而准确地复性，而线状的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，不能迅速而准确地复性，它们缠绕形成网状结构。通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来，而质粒DNA却留在上清液中。
二、实验步骤：
1. 吸取1.5mL菌液于1.5mL离心管中，4℃下12000rpm离心2min，吸干上清液，使细菌沉淀尽可能干燥。
2. 加入100μLSolutionⅠ，枪头充分打匀，使细胞重新悬浮。
3. 加入200μL新配制的SolutionⅡ，轻柔颠倒混匀（千万不要振荡），冰上放置至清亮（小于5min）。
4. 加入150μLSolutionⅢ，颠倒混匀（温和振荡10秒），使溶液Ⅲ在粘稠的细菌裂解物中分散均匀冰浴10min，使杂质充分沉淀。
5. 4℃下12000rpm离心15min，小心将上清转至新的1.5mL离心管中。
6. 加入6μL10μg/L的RaseA，混匀，37℃温浴30min。
7. 等体积TriS饱和酚：氯仿：异戊醇（25:24:1）抽提1次，小心将上清吸至新的1.5mL离心管中。
8. 等体积氯仿：异戊醇（24:1）抽提1次，小心将上清吸至新的1.5mL离心管中。
9. 加入2.5倍体积的冰冻无水乙醇，冰浴0.5-1h，沉淀双链DNA。
10. 4℃下12000rpm离心5min，吸干上清液。
11. 加入70%乙醇1mL，颠倒数次，使质粒悬浮，12000rpm离心5min。
12. 吸干上清液，12000rpm离心1min，吸干乙醇。
13. 室温放置或超净工作台上风干质粒DNA约10min。
14. 加20μL灭菌ddH2O或TE缓冲液充分溶解。
三、注意事项：
1. 提取过程应尽量保持低温。
2. 提取质粒DNA过程中除去蛋白很重要，采用酚/氯仿去除蛋白效果较单独用酚或氯仿好，要将蛋白尽量除干净需多次抽提。
3. 沉淀DNA通常使用冰乙醇，在低温条件下放置时间稍长可使DNA沉淀完全。
4. 质粒DNA电泳会有三条带，最远的是线形DNA（lDNA）：质粒的两条链均断裂，线性分子；中间的是开环DNA（ocDNA）：质粒的一条链断裂，松弛的环状分子；共价闭合环状DNA（cccDNA）：质粒的两条链没有断裂，超螺旋相关。
四、相关溶液的作用：
1. 溶液I的作用：溶液I是一种缓冲液，主要用于控制pH值和添加葡萄糖防止细菌沉积。EDTA是一种螯合剂，能够抑制DNase的活性和微生物生长。
2. 溶液II的作用：溶液II是一种细胞裂解液，主要用于裂解细胞壁。NaOH是最佳的溶解细胞的试剂，可以溶解大肠杆菌和哺乳动物细胞。
3. 溶液III的作用：溶液III是一种高盐缓冲液，主要用于沉淀染色体DNA和蛋白质-SDS复合物。
质粒DNA的提取碱裂解法是一种常用的实验方法，能够快速、高效地提取质粒DNA。但是，需要注意实验步骤和注意事项，以确保实验的成功。
