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2023年QC七大手法基因工程复习归纳重点资料.doc
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2023年QC七大手法基因工程复习归纳重点资料.doc
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基因工程复习归纳
第一章 绪论
1.基因工程的定义:是指按照人们的愿望,通过严密的设计,将一种或多种生物体(供体)的基因
与载体在体外进行拼接重组,然后转入另一种生物体(受体/宿主)内,使之按照人们的意愿稳定
遗传、并表达出新的性状的技术。
2.基因工程概念的发展:遗传工程→DNA重组技术→分子/基因克隆(Molecular/Gene→基因工程→
基因操作。应用领域以“基因工程”、“DNA重组”为主
基因工程基因工程的历史性事件
1973:Boyer和Cohen建立DNA重组技术
1978:Genetech公司在大肠杆菌中表达出胰岛素
1982:世界上第一个基因工程药物重组人胰岛素上市
1988:PCR技术诞生
1989:我国第一个基因工程药物rhIFNα1b上市
2023: 世界上第一个基因治疗药物重组腺病毒-p53上市
3.基因工程的三大关键元件
基因(供体):外源基因、目的基因
载体:能将外源基因带入受体细胞,并能稳定遗传的DNA分子(克隆载体、表达载体)。
宿主(受体):,能摄取外源DNA、并能使其稳定维持的细胞(组织、器官或个体)。
4.基因工程的基本环节(切、接、转、增、检(大肠杆菌是中心角色)
(1)目的基因的获取:从复杂的生物基因组中,通过酶切消化或PCR扩增等环节,分离出带有目
的基因的DNA片断。
(2)重组体的制备:将目的基因的DNA片断插入到能自我复制并带有选择性标记(抗菌素抗性)
的载体分子上。
(3)重组体的转化:将重组体(载体)转入适当的受体细胞中。
(4)克隆鉴定:挑选转化成功的细胞克隆(具有目的基因)。
(5)目的基因表达:使导入寄主细胞的目的基因表达出我们所需要的基因产物。
第二章 DNA重组克隆的单元操作
一、用于核酸操作的工具酶
1. 限制性核酸内切酶(重要存在于原核细菌中,帮助细菌限制外来DNA的入侵)。
限制性核酸内切酶的功能与类型
重要特性
I型
II型
III型
功能
限切/修饰
限切
限切/修饰
蛋白结构
异源三聚体
单体
异源二聚体
辅助因子
ATP Mg2+ SAM
Mg2+
ATP Mg2+ SAM
辨认序列
TGAN8TGCT
AACN6GTGC
旋转对称序列
GAGCC
CAGCAG
切割位点
距辨认序列1kb处
辨认序列内
距辨认序列下游
24-26bp处
其中II型限制性核酸内切酶:切割位点专一,适于DNA重组,是DNA重组中最常用工具酶。
特点:1.辨认、并切割双链DNA分子中特异序列的DNA内切酶。2.辨认序列为4-
6碱基对的回文对称结构(旋转对称结构)。3.单体蛋白、仅有限制性内切酶活性,无甲基化酶活
性。4.切割产物末端:5’突出末端、3’突出末端、平头末端.6.最适温度:大多为37℃,适盐浓度:高
盐、中盐、低盐。8.当反映条件不适合时,辨认和切割序列发生变化(星号反映)。
星活性(star
activity):在极端非标准条件下,限制酶能切割与辨认序列相似的序列,这个改变的特殊性称星
活性。
引起星活性的因素: ① 高浓度甘油(>5%)、② 酶过量(>100U/mg)、③
低离子强度(<25mM)
④ 高pH (>pH8.0)、⑤ 有机溶剂、⑥ 用其它二价阳离子代替Mg2+,如Mn2+,Cu2+,Co2+, Zn2+。
II型限制性核酸内切酶的命名
具体规则是:以生物体属名的第一个大写字母和种名的前两个小写字母构成酶的基本名称,假如
酶存在于一种特殊的菌株中,则将株名的一个字母加在基本名称之后,若酶的编码基因位于噬菌
体(病毒)或质粒上,则还需用一个大写字母表达这些非染色体的遗传因子。酶名称的最后部分
为罗马数字,表达在该生物体发现此酶的先后顺序。
例子:Eschericha(属名)coli(种名)R (质粒)
大肠杆菌
R
质粒
—EcoR I EcoR V
Haemophilus(属名) influenzae(种名) d(株名) 嗜血流感杆菌d株-- H i n d II H i n d
III。罗马数字表达同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶。
特殊性质的II型限制酶:同裂酶,同尾酶
同裂酶:又称异源同序酶或异源同工酶,是指辨认位点与切割位点均相同的不同来源的酶辨认相
同序列,如HindIII – HsuI: A / AGCTT
同尾酶:是指辨认位点不同,但切出的DNA片段具有相同的末端序列的一类酶,如BglII:A /
GATCT;BamHI: G /
GATCC。同尾酶的切割产物互为粘性末端,并能连接,但连接后二个酶的辨认序列均被破坏。
2.DNA连接酶(T4-DNA连接酶)
功能:体外连接DNA片段
常用的连接酶:T4 DNA连接酶
参与连接反映的基团:3端羟基和5端磷酸基团,形成磷酸二酯键
DNA连接酶的基本性质 :修复双链DNA上缺口处的磷酸二酯键、修复RNA-
DNA杂合分子中DNA链上缺口处的磷酸二酯键、连接多个平头双链DNA分子
T4 DNA连接酶的活性单位定义:在 20μl 反映体系中于 16℃ ,使 HindⅢ 切过的 l DNA
(300μg/ml,0.12μM 5' 末端)在 30 分钟内连接 50% 所需的酶量为 1 个 NEB 单位。
3.DNA聚合酶
①大肠杆菌DNA聚合酶 I( DNA pol I )
基本性质:1. 5‘→3‘的DNA聚合酶活性 2. 5‘→3‘的核酸外切酶活性 3. 3‘→5‘的核酸外切酶活性
大肠杆菌DNA聚合酶 I 的基本用途:1.切口平移标记法 2.Nick translation
3.制备32P标记的探针。所有的DNA聚合酶中只有此酶有该反映。缺口平移标记原理见ppt。
大肠杆菌DNA聚合酶 I 大片段( Klenow
酶):大肠杆菌DNA聚合酶I经枯草杆菌蛋白酶解决,获得N端三分之二的大肽段,即为Klenow酶。
Klenow酶仍拥有5‘→3‘的DNA聚合酶活性和3‘→5‘的核酸外切酶活性,但失去了5‘→3‘的核酸外切酶
活性。
Klenow酶的基本用途:1. 补平由核酸内切酶产生的5‘粘性末端 2.DNA片段的同位素末端标记
3.cDNA第二链的合成 4.双脱氧末端终止法测定DNA序列。
②T4-DNA聚合酶
基本特性:1.5‘→3‘的DNA聚合酶活性和3‘→5‘的核酸外切酶活性(极强) 2.
在无dNTP时,可以从任何3‘-OH端外切 3.在四种dNTP均存在时,聚合活性占主导地位
基本用途:1.切平由核酸内切酶产生的3’粘性末端,该酶也能降解双链DNA,只是其活性比单链降
解活性低很多。2.DNA片段的同位素末端标记。
③依赖于RNA的DNA聚合酶(反转录酶)
基本用途:1. 以RNA为模板合成cDNA链 2.双向外切DNA-RNA杂合链中的RNA链
4.核酸酶
单链核酸外切酶:核酸外切酶VII(ExoVII);双链核酸外切酶:核酸外切酶
III(ExoIII);双链核酸外切酶:λ核酸外切酶(λExo)【特异性地从5‘
端外切】;单链核酸内切酶:S1核酸酶【降解单链DNA的速度比降解双链DNA快75000倍,比降解
单链RNA快7倍】
5.核酸修饰酶
末端脱氧核苷酰转移酶(TdT);碱性磷酸单酯酶【小牛胸腺的碱性磷酸单酯酶(CIP)&大肠杆菌
的碱性磷酸单酯酶(BAP)】;T4-多核苷酸磷酸激酶(T4-PNP)
二、用于克隆的载体
1. 载体(Vector):是把外源DNA(目的基因)导入宿主细胞,使之传代、扩增或表达的工具。
载体应具有的条件:
1.具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性(可转移性)2.
具有与特定受体细胞相适应的复制位点或结合位点 3. 具有较高的外源DNA的载装能力 4.
具有多种单一的核酸内切酶辨认切割位点(多克隆位点 ) 5. 具有合适的筛选标记
2.载体类型:
(1)根据重要用途可以分为:克隆载体和表达载体
①克隆载体:重要用于在大肠杆菌细胞中克隆目的基因,或在大肠杆菌或酿酒酵母细胞中构建基
因文库。
克隆载体关键元件:A.多克隆位点 B.筛选标记基因 C.复制起始位点
②表达载体:除含基因克隆所需元件外,尚有供外源基因表达用的启动子、终止子等顺式元件,
用于在特定的宿主中表达目的基因。
(2)按传代特性分:
①自主复制型载体:含复制子,可独立于宿主染色体外复制与传代(穿梭载体:装有针对两种不
同受体的复制起点,便于基因克隆)。
②整合型载体:不含复制子,需借助同源重组机制整合于宿主基因组。
3.分子克隆载体常用类型:
(1)质粒:15kb以下
严紧型复制控制的质粒:1 - 5 拷贝,如pSC101
松弛型复制控制的质粒:30 - 50 拷贝,如 ColE1
氯霉素扩增:在宿主菌生长的中后期,通过添加氯霉素克制蛋白质合成、关闭重要代谢途径,以
使松弛型质粒 迅速大量扩增(可达上千拷贝)的操作。
质粒载体的特点:分子量小,便于操作;易于构建,可作为其他宿主系统载体的骨架;用途广泛
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