实时荧光定量PCR的原理操作及其应用PPT学习教案.pptx

实时荧光定量PCR（Quantitative Real-Time PCR，qPCR）是一种在PCR扩增过程中实时监测荧光信号变化，从而实现对DNA模板定量分析的技术。它由美国Applied Biosystems公司在1996年推出，因其高特异性、高灵敏度和自动化程度而广泛应用于生物学、医学研究和临床诊断。 qPCR的基本原理是，在PCR反应体系中添加荧光标记的探针或染料，如SYBR Green，这些荧光物质会随着PCR扩增过程中双链DNA的增加而释放出荧光。荧光信号的变化被实时记录，形成扩增曲线。扩增曲线的纵坐标代表荧光强度，横坐标代表PCR循环数。当荧光信号达到预设阈值时，对应的循环数称为Ct（Cycle Threshold）值，Ct值与起始模板量呈反比，即模板量越多，达到阈值所需的循环数越少。 荧光阈值是根据样本的荧光背景和阴性对照设定的一个界限，一般在指数增长阶段初期设定，确保只有特异性扩增产物的荧光信号被记录。Ct值是重要的参数，它能用于绝对定量分析和相对定量分析。在绝对定量中，通过Ct值与标准曲线对比可以确定未知模板的初始浓度；在相对定量中，比较不同样本的Ct差值，可以分析目标基因表达水平的相对变化。 qPCR中常用的荧光标记有两种：非特异性荧光染料SYBR Green和特异性荧光标记，如TaqMan探针和Molecular Beacon。SYBR Green的优点在于成本低，但可能因非特异性结合导致假阳性结果。TaqMan探针和Molecular Beacon则具有更高的特异性，因为它们通常带有特定的荧光标记和淬灭基团，只在特定的靶序列上产生荧光信号。 在操作qPCR时，需要注意的环节包括样品制备、引物和探针设计、标准品的制备、通道和增益的选择、标准曲线的建立、加样细节、阈值选定、熔解曲线分析等。熔解曲线分析是验证扩增特性的关键步骤，通过分析熔解温度（Tm）来确认扩增产物的单一性。 应用方面，qPCR不仅可以进行绝对和相对定量分析，用于检测基因表达水平、病毒载量等，还可以用于单核苷酸多态性（SNP）检测，对遗传变异进行分析。在科学研究和临床实践中，qPCR已成为不可或缺的分子生物学工具，为生物学、医学、农业等领域提供了有力的技术支持。