荧光定量PCR原理扩增曲线PPT学习教案.pptx

荧光定量PCR（Quantitative Real-Time Polymerase Chain Reaction, qPCR）是一种在PCR反应过程中实时监测荧光信号，从而分析样本中目标DNA序列含量的方法。它通过监测每次循环的荧光信号强度变化，来确定扩增产物的积累，进而计算出起始模板的数量。 荧光定量PCR的核心在于扩增曲线，这是一条描绘荧光强度随循环数增加而变化的曲线。在初期的几个循环，荧光信号较低，通常前15个循环的荧光强度作为背景基线。当荧光信号超过某个阈值（荧光域值），即达到设定的标准偏差的10倍时，称为Ct值（Cycle Threshold）。Ct值是衡量扩增产物积累的关键指标，它表示PCR扩增到足以被检测到所需循环次数。模板DNA的初始浓度越高，荧光达到阈值的循环数越少，Ct值也就越小。Ct值与对数模板起始浓度呈线性关系，这使得荧光定量PCR能够对样本进行相对或绝对定量。 荧光标记方法主要有两种：SYBR Green I和TaqMan探针。SYBR Green I是一种能与所有dsDNA结合的染料，在双链DNA形成时发出荧光。其优点在于使用简单，成本较低，但缺点是可能会与非特异性扩增或引物二聚体结合，导致检测结果不准确。为解决这个问题，可以通过优化引物设计和分析融解曲线来减少非特异性结合。融解曲线分析可以帮助识别特异性扩增产物，单一峰表明扩增准确，而杂峰则可能指示非特异性扩增。 荧光定量PCR广泛应用于基因表达分析、病原体定量、SNP分析、基因拷贝数测定、GMO检测等。在实验流程中，需确保PCR扩增效率在0.8至1.2之间，且在35个循环内获得良好的定量结果。同时，通过检测相关系数（r²）确认反应的线性关系，以提高实验的可靠性。 TIANGEN等公司提供荧光定量PCR相关产品和服务，包括选择适合的荧光标记试剂和PCR反应体系，以确保实验的准确性和稳定性。在实际操作中，应根据具体研究需求和实验条件选择合适的方法和产品，遵循最佳实践，以确保荧光定量PCR实验的可靠性和准确性。