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大视场微球透镜超分辨显微成像技术的研究进展.docx
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大视场微球透镜超分辨显微成像技术的研究进展.docx
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0. 引 言
由于存在衍射极限,传统的显微镜不能分辨 200 nm 以下的物体
[1]
。为突破衍射极限限
制以获取超分辨显微图像,是科学研究的前沿热点领域之一。多种代表性的技术方法相继
出现,如基于荧光的超分辨技术: 受激发射损耗(STED)显微技术
[2]
、 光激活定位显微
(PALM)技术
[3]
,基于结构光照明显微 (SIM)技术
[4]
,基于表面等离子激元 (SPP)
的超分辨显微技术
[5]
等等。然而,这些方法或者仪器搭建复杂;或者必须对样品进行荧光
标记,不可避免会污染样品;又或者需要后期进行数据处理,因此研究人员仍在不断探索
新的技术。
2004 年,Zhigang Chen 等
[6]
发现当平面波照射微米级介电圆柱体侧表面时,圆柱体阴
影面可以产生局部纳米级光子射流,该光场强度比入射光增强几个数量级。这一研究首次
为微球透镜超分辨显微成像提供了理论依据。2011 年,英国曼彻斯特大学的王增波等
[7]
第
一次通过微球超分辨技术实验获得蓝光光盘表面的精细结构,实现 50 nm 的超分辨效果。
此后,基于微球透镜的超分辨显微技术得到快速发展,研究者们围绕微球透镜超分辨显微
成像的基础理论、技术方案、应用测试等诸多方面进行了大量的研究。
虽然微球透镜超分辨显微成像技术具有肉眼实时观测,时间分辨率高,无需荧光标
记,设备简单,方便实施等优点,但微球通常需要撒落样品表面进行成像,其位置具有随
机性,很难实现指定位置的准确观察。并且,受微球尺寸的限制,单个微球观察到的视野
十分有限。当增加微球尺寸时,视野虽然会增加,但放大倍率和分辨率也会发生变化,对
微球透光性的要求也会更高
[8]
。这些局限性限制了微球透镜超分辨显微成像技术的进一步
发展和拓展应用,因此,为了提高微球透镜进行超分辨显微成像的可操纵性,拓展超分辨
显微成像视野范围,研究者们展开了一系列富有成效的研究。文中将介绍微球透镜超分辨
显微成像的技术原理和基本实验方案,归纳影响微球透镜超分辨图像性质的因素,重点总
结最新操控微透镜移动和拓展微球透镜超分辨显微成像视场的方法,并对该技术未来的发
展进行讨论。
1. 微球透镜超分辨显微成像技术原理
由于微球直径通常要求在微米级别,与探测光的波长量级相同,光在微球上的散射效
应无法忽略。通常认为,经典几何光学理论在这一尺度上关于焦点、焦距和放大率等理论
并不准确,无法合理揭示微球透镜显微成像的机理。然而,新发展起来的倏逝波传输理论
和光子纳米喷流效应一定程度上解释了衍射极限的突破现象,为微透镜超分辨显微成像提
供了理论基础。
1.1 倏逝波传输
物体受光波照射后,离开表面的光波分为两种:一部分光向远方传播,被传统光学显
微镜接收;另一部分光波只能沿物体表面传播,一旦离开表面就很快衰减,这部分光被称
作倏逝波。倏逝波携带物体的高频图像信息,但在一般情况下无法被显微物镜接收。微球
透镜能把近场的倏逝波耦合进入内部,将其转变成可以在远场传播的传播波并被物镜接
收。在微球透镜中会激发回音壁模式(Whispering gallery mode, WGM),分辨率可以通过
WGM 增强而超过衍射极限
[9]
。
Ben-Aryeh Y
[10-12]
对微球透镜把倏逝波转变成传播波的条件及过程进行了分析,如图 1
所示,设入射光波的水平波数为 uu,垂直波数为 ww,则介质和微球分界面 P 处入射波的
水平分量为:
图 1 微球透镜耦合倏逝波原理图
[12]
Fig. 1 Schematic diagram of evanescent wave coupled with microsphere lens
[12]
下载: 全尺寸图片 幻灯片
u′=(ucosθ)2−(|w|sinθ)2−−−−−−−−−−−−−−−−−√u′=(ucosθ)2−(|w|sinθ)2
当水平分量小于微球内部所允许传播的最大波数时,将会转化为传播波,即:
u′<nk0u′<nk0;为了避免微球透镜内部的传播波无法传递到远场, 水平分量应小于周围浸没
介质的波数,即:u′<nlk0u′<nlk0。其中,nn 为微球折射率,nlnl 为微球周围浸没介质折射
率,k0k0 为单位长度上产生的波数变化,即波数。
理论上,提高微球透镜的折射率 nn 和周围浸没介质的折射率 nl,nl,则微球耦合的
高频成分增加,成像的分辨率提升。由于倏逝波竖直方向快速衰减的特点,微球透镜耦合
近场光学信息受到高度限制,仅能将距离样品表面一定高度范围内的倏逝波加以耦合并将
其传递至远场。
1.2 光子纳米喷流效应
平行(或称准直)光束经介电圆柱或者微球聚焦,在其背光面会出现一个喷射长度大
于波长尺寸,喷射光束宽度处于亚波长量级的超强聚焦光场,这个现象称为光子纳米喷流
效应。Mie 理论对球形粒子光散射进行了完整描述,其基于麦克斯韦方程组,可以严格求
出在平面波照射下,微粒在均匀且各向同性的介质中,散射场及内场的精确解。即可给出
光子纳米喷流效应的形成,从而构建系统电磁场的分布情况,进一步对其性质进行研究
[13]
。微球透镜和传统透镜所形成的焦点类似,但是其形成机理与性质却不相同,形成光子
纳米喷流的位置与微透镜类型和周围介质的折射率有关。从聚焦的角度分析,微球产生的
纳米喷流越细,微球的聚焦效果越好,分辨率越高
[14]
。
光子纳米喷射需要用一些参数来表征。如图 2 所示,喷射光强最大的点即为聚焦点,
从微球的球心到聚焦点的距离为微球系统的焦距( f )。喷射长度(z
r
)定义为从光强最大
值(I
max
)点到沿轴方向光强衰减到 Imaxe2Imaxe2 那一点的距离。半最大值全宽(FWHM)指
在光强最大值位置处,光强最大值一半的横向距离。半最大值全宽被广泛应用于评价超分
辨性能,其值越小,即束腰(w
0
)的宽越窄,超分辨能力越强。普遍认为,当光强越大、
焦距越短、纳米喷流的纵向延续长度越长、半高全宽越小时,超分辨显微成像效果越好。
且焦点位置在微球外内影响超分辨显微成像虚实
[15]
。
图 2 光子纳米喷射原理示意图
[15]
Fig. 2 Schematic diagram of photon nanojet
[15]
下载: 全尺寸图片 幻灯片
微球超透镜成像的放大倍率、分辨率等性质参数与光子纳米喷射表征参数有一定联
系。光子纳米射流的束腰和微球与最大电强度位置之间的距离决定了超分辨显微成像的能
力,并随微球的折射率和尺寸发生变化
[16]
。微球的尺寸减小时,纳米射流的束腰也减小。
纳米射流形成在靠近微球表面时,有利于提高分辨率和放大率
[17]
。由于光子纳米射流现象
既超出了近场光学范畴(一个波长以内),又不属于传统远场光学(毫米量级及以上),
因此其是一种准近场光学现象,所以只有当观测样品与介质微球之间的距离在约 20 个波长
以内时,微球才具有超分辨能力。同时以光子射流热点区域为焦点,可以推断出图像的性
质(实像和虚像),及像面位置和微球放大率的趋势
[18]
。
2. 微球透镜超分辨显微成像质量的影响因素
微球透镜超分辨显微成像技术是一种简单快速地得到样品超分辨图像的方法。该方法
将微球放在样品表面,利用显微镜透过微球观察样品表面结构,从而实现超分辨显微成
像。针对微球超分辨图像,主要关注其放大倍率、分辨率和视场大小等基本性质。而微球
的直径和类别、介质环境和浸没深度、物镜参数和照明方式等都会影响图像的质量。这些
因素的改变会引起成像效果的变化,因此研究人员希望通过探究这些因素对超分辨图像性
质的影响,使成像质量得到提高。
2.1 微球的直径和类别
微球透镜的主要可变参量为直径和类别。选择不同尺寸或材质的微球会引起分辨率的
改变。Darafsheh A 等
[19]
将不同直径的钛酸钡微球完全浸没在异丙醇溶液中对金纳米粒子二
聚体进行超分辨显微成像。如图 3(b)~(d)中白色虚线,沿两个纳米粒子的轴测量图像强
度,得到黑色曲线,拟合结果为一个双峰结构,由红色虚曲线表示。两个峰之间越陡峭表
示两个纳米粒子区分度越高,可知随着微球直径的增加,图像的分辨率降低。此外,他们
还将直径均为 53 μm 的纳钙玻璃微球(折射率 n=1.51)在空气中成像,钛酸钡微球(折射
率 n=2.1)用异丙醇完全浸没成像,如图 4(a)所示,发现钛酸钡微球对蓝光光盘成像分辨率
更高
[20]
。由此可见,微球直径和类别是超分辨图像分辨率的重要影响因素,只需简单更换
微球的尺寸和材料,就能根据样品需求得到不同的成像效果。
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