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微球透镜近场聚焦及远场成像仿真研究进展.docx
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微球透镜近场聚焦及远场成像仿真研究进展.docx
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v0. 引 言
自 16 世纪末第一台光学显微镜在荷兰问世以来,光学显微技术经历了不断的革新。
它已经从简单的单透镜成像装置发展成为了一种极为重要且精密的观察与计量科学仪器,
广泛地应用于生物、化学、物理、冶金、酿造、医学等各种科研活动,对人类的发展做出
了巨大而卓越的贡献。特别是在生命科学领域,光学显微技术引领着人类打开微生物世界
的大门,为生命科学研究与现代临床疾病诊断提供有力的影像学依据,成为推动生命科学
和基础医学进步不可或缺的重要工具。
自诞生来,光学显微镜的发展一直所面临着一个巨大挑战—“分辨率”。自恩斯特·阿贝
(Ernst Abbe)1873 年发表著名的阿贝分辨率极限公式以来
[1]
,人们一直认为显微镜的分辨
率只有光波长的一半。对可见光而言,这个数值最小约为 200 nm。于是,物理学家很自然
地将思路转向波长更短的射线,发明了电子显微镜和 X 射线显微镜。这两种显微镜都能达
到纳米甚至更高的分辨率。可惜这两种显微镜都无法对生物活体进行有效且无损的观测。
1962 年,下村修(Osamu Shimomura)
[2]
从生活在美国西海岸近海的翼钟水母身上提取、
鉴定出了绿色荧光蛋白。这种绿色荧光蛋白使通过设备肉眼观察、追踪被标记的活体细胞
成为可能。荧光显微镜
[3]
、激光共聚焦显微镜
[4]
、全内反射荧光显微镜
[5]
、双/多光子荧光显
微镜
[6-7]
、光片显微镜
[8-9]
等的问世极大地促进了生命科学研究水平的进步。这些技术允许检
测非常微弱的荧光信号,并以高特异性揭示样品的结构和功能特性,为生物与医学研究带
来了一场革命。2008 年,诺贝尔化学奖授予了绿色荧光蛋白,标志着以荧光蛋白为基础的
现代分子成像技术已经成为了当代生命科学研究中与显微镜的发明相提并论的最重要的工
具之一。更加让人意想不到的是,荧光分子开关效应的发现和单分子探测技术的出现,使
连续观测单个荧光分子行为而非其集合平均成为可能。受激发射损耗显微镜(STED)
[10]
、
光敏定位显微镜(PALM)
[11]
、随机光学重建显微镜(STORM)
[12]
等超分辨成像技术利用
荧光分子的受激辐射原理与光开关效应,绕开了一百多年来似乎一直被认为是无法突破的
阿贝衍射极限,将光学显微技术带入到纳米尺度。2014 年,诺贝尔化学奖授予了超分辨率
荧光显微技术,再一次展现了光学显微技术在人类发展历程中以及未来发展方向上的重要
地位。
截止目前,荧光显微技术已逐步实现从 2D 宽场到 3D 共聚焦/双光子与超分辨的跨
越。然而这类方法仍需要挑选具备合适发色团的样本,或者对样本进行荧光标记处理以提
高成像的特异性和衬度。实际上,无论是哪种标记方法,都存在一定的局限性
[13]
:首先,
荧光染色本身就是个复杂耗时的过程,且荧光标记物不可避免地对细胞机体的正常代谢活
动产生不利影响;其次,激发光对细胞的光损伤较大,荧光基团还存在光漂白的问题,这些
阻碍了对细胞的长时间连续观测;最后,细胞内某些重要组分,如小分子和脂类的特异性
不高,荧光标记往往只能突出部分生物分子而难以获得细胞整体全貌。
在研究活细胞的动态过程及其各项生理活动时,无标记(Label-free)显微是一种最为
理想的探测手段
[14-15]
。当光通过几乎透明的物体(如细胞)时,其振幅几乎不变;然而透
射光的相位则包含了关于样品的重要信息,如形貌与折射率分布。1932 年,Zernike 基于
这种想法发明了相差显微镜:利用光的衍射和干涉特性并根据空间滤波的原理改变物光波
的频谱相位,成功将相位差转换成振幅差,从而极大地提高了透明相位物体在光学显微镜
下的可分辨性
[16]
。相衬法的发明具有划时代的意义,Zernike 因此获得 1953 年的诺贝尔物
理学奖。同期,各类无标记显微技术也得到了快速发展,例如用来观测散射物体的暗场显
微镜,用来观测晶体的偏振显微镜等,这些技术已在各类无标记成像研究应用中无处不
在。然而,这些技术从发展初期到现在并没有经历太大的革新,且成像分辨率仍然受到阿
贝衍射极限的限制,无法实现超分辨成像。不论是理论与技术方面的发展与荧光显微成像
相比都显著滞后。如何在“无标记”的前提下实现超分辨显微成像,是目前显微镜技术发展
亟待突破的一大重点与难点。
1972 年,近场扫描光学显微技术(Near-field scanning optical microscopy, NSOM)诞生
了,其基本原理是利用孔径小于入射光波长的针孔对样品表面倏逝波进行收集。倏逝波是
一种沿介质界面传播、振幅垂直于界面的电磁波,其在传播过程中可携带物体的高频率亚
波长空间信息
[17]
。NSOM 技术使得人们首次能够突破光学衍射的限制,进行亚波长超分辨
成像。虽然 NSOM 技术的成像分辨率远优于传统光学显微镜,但倏逝波的振幅在与样品表
面垂直的传播方向上会随距离的增大呈指数衰减,在该方向上的传播距离只有入射波长量
级。因此,必须在待测样品的近场区探测,通过探针逐点扫描的方法进行成像,这也使得
整个系统复杂且成像缓慢,无法实现实时的生物检测,极大限制了该技术的应用
[18]
。
1. 微球成像技术的发展与现状
2009 年,韩国浦项科技大学(Pohang University of Science and Technology)的 J.-Y. Lee
等人首先报道了微米透镜具有超分辨成像能力
[19]
。该团队通过化学方法制备了直径 0.05~3
µm、厚度小于 0.8 µm 的 C
28
H
24
O
8
(CHQ)平凸透镜(n=1.50),并利用 CHQ 微透镜成功在
高倍物镜(100×, 0.9 NA)下对间隔 250 nm 和 220 nm 的 Pd/Cr 金属线条进行了显微成像,
从而证明了 CHQ 微透镜的分辨能力已超越了 Abbe 分辨率极限,可达到 0.34λ/NA。他们用
时域有限差分法(Finite difference time domain, FDTD)对 CHQ 微透镜的近场聚焦现象进行了
仿真研究,发现用 FDTD 法算出的微透镜焦距远小于用光线追迹法算出的焦距(图
1(a))。2011 年,英国曼彻斯特大学(University of Manchester)的 Z. Wang 等人
[20]
利用直
径 2~9 µm 的 SiO
2
微球(n=1.46)结合 80×,0.9 NA 的物镜成功在卤素灯照明下实现了 50
nm 微结构的观测,其成像系统分辨率能达到 λ/8~λ/14,放大率介于 4~8 倍之间,并通过该
成像系统成功分辨出了线宽 200 nm、间距 100 nm 的光栅结构,以及直径~50 nm、间距~50
nm 的非周期圆孔结构(图 1(b))。Wang 等人通过将直径 4.87 µm 的 SiO
2
微球与直径 2.5
mm、高度 0.5 mm 的 SiO
2
固体浸没透镜进行对比发现微透镜的分辨能力远超固体浸没透
镜。同年,浙江大学刘旭团队发现当在微球上滴加酒精后,酒精液膜厚度会因为蒸发现象
而逐渐减小到与微球直径相当或者小于微球直径,此时微球的超能分辨成像质量会得到显
著提升。利用该方法,他们通过直径 3 µm 的 SiO
2
微球对蓝光光碟表面条纹进行了对比度
增强超分辨成像
[21]
。2012 年,美国北卡罗来纳大学夏洛特分校(University of North
Carolina at Charlotte)的 A. Darafsheh 发现直径为 2~220 µm 的 BaTiO
3
微球(n~1.9~2.1)在液
体完全浸没时同样具有超分辨成像能力,其分辨率最高能达到 λ/7,当微球的直径大于 50
µm 时,其分辨率约为 λ/4。他们利用异丙醇完全浸没的 BaTiO
3
微球成功实现了对间距 150
nm、直径 120 nm、高度 30 nm 的周期性金点阵的超分辨成像
[22]
。此后,聚苯乙烯
[23]
、
TiO
2
-BaO-ZnO 微球
[24]
等不同材料微球均被证实具有超分辨成像能力,并相继衍生出了微球
辅助共聚焦显微成像技术
[25]
、扫描微球超分辨成像技术
[26-27]
等相关技术。
近年来,国内众多课题组也针对此方向开展了相关研究工作:中国科学院沈阳自动化
所刘连庆团队将微球与原子力显微镜悬臂粘结,结合图像拼接技术实现了非接触大面积扫
描超分辨成像(图 1(c))
[26]
,并将该方法拓展到微操控领域提高了可视化微操控的精度
[28]
。其团队还研究了级联型微透镜组的成像特性,并实现了无浸没高质量超分辨成像
[29]
。
复旦大学武利民团队通过自组装技术将粒径为 15 nm 的 TiO
2
颗粒组装成直径 10 µm 的透
镜,并实现了对 45 nm 微结构的光学显微成像(图 1(d))
[30]
。暨南大学李宝军团队利用光
力操控 C
10
H
7
Br 液滴,通过改变液滴外形可对其超分辨成像特性进行实时调控(图 1(e))
[31]
。南京师范大学叶永红课题组研究了 SiO
2
微球和 BaTiO
3
微球的远场成像特性,建立了
成像视场、放大率和物距之间的关系
[32–34]
,成像系统景深和光子射流长度之间的关系
[35]
,
并采用半浸没结构提高了微球透镜的数值孔径和分辨能力
[36]
,改善了成像畸变
[37]
,通过在
基板表面制备高反膜提高了成像对比度
[38]
。2020 年,叶永红课题组发现在样品表面沉积金
属-介质膜也可提高微球成像系统的分辨率和对比度
[39]
(图 1(f)),并对微球超分辨成像的
物理机制进行了研究
[40]
。
图 1 (a) CHQ 透镜超分辨显微成像
[19]
;(b) SiO
2
微球超分辨显微成像
[20]
;(c)微球扫描超分
辨显微成像
[26]
; (d) TiO
2
颗粒自组装超分辨显微成像
[30]
;(e)液体透镜超分辨显微成像
[31]
;(f)
表面等离激元增强超分辨显微成像
[39]
Fig. 1 (a) CHQ microlens-assisted super-resolution microscopy
[19]
; (b) SiO
2
microsphere-assisted
super-resolution microscopy
[20]
; (c) Scanning microsphere super-resolution microscopy
[26]
; (d)
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