剑桥大学2018年单细胞转录组分析教程

Analysis of single cell RNA-seq data

Vladimir Kiselev (wikiselev), Tallulah Andrews, Jennifer Westoby (Jenni_Westoby), Davis

McCarthy (davisjmcc), Maren Büttner (marenbuettner) and Martin Hemberg (m_hemberg)

2018-02-27

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Contents

1 About the course 7

1.1 Video . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7

1.2 Registration . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7

2 Introduction to single-cell RNA-seq 9

2.1 Bulk RNA-seq . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9

2.2 scRNA-seq . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9

2.3 Workow . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9

2.4 Computational Analysis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10

2.5 Challenges . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10

2.6 Experimental methods . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12

2.7 What platform to use for my experiment? . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14

3 Processing Raw scRNA-seq Data 17

3.1 FastQC . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17

4.1 Reads QC . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33

4.2 Reads alignment . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33

4.3 Alignment example . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34

4.4 Mapping QC . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35

4.5 Reads quantication . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35

4.6 Unique Molecular Identiers (UMIs) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36

5 Introduction to R/Bioconductor 41

5.1 Installing packages . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41

5.2 Installation instructions: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42

5.3 Data-types/classes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42

4 CONTENTS

6 Tabula Muris 65

6.1 Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 65

6.2 Downloading the data . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 65

6.3 Reading the data (Smartseq2) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 66

6.4 Building a scater object . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 68

6.5 Reading the data (10X) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 69

6.6 Building a scater object . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71

6.7 Advanced Exercise . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 72

7 Cleaning the Expression Matrix 73

7.1 Expression QC (UMI) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 73

7.8 Normalization practice (UMI) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 119

7.9 Normalization practice (Reads) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 132

7.10 Dealing with confounders . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 140

7.11 Dealing with confounders (Reads) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 168

8 Biological Analysis 187

8.1 Clustering Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 187

8.2 Clustering example . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 191

8.3 Feature Selection . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 207

8.4 Pseudotime analysis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 217

8.5 Imputation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 253

9.2 Expression QC . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 305

9.3 Normalization . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 307

9.4 Highly variable genes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 307

9.5 Dealing with confounders . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 308

9.6 Linear dimensionality reduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 314

9.7 Signicant PCs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 317

9.8 Clustering cells . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 319

9.9 Marker genes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 321

9.10 sessionInfo() . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 324

10 “Ideal” scRNAseq pipeline (as of Oct 2017) 327

CONTENTS 5

12.3 scRNA-seq analysis tools . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 333

12.4 scRNA-seq public datasets . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 333