转BADH基因马铃薯无性繁殖二代耐盐性的鉴定资源-CSDN文库

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转 BADH 基因马铃薯无性繁殖二代耐盐性的鉴定

李东魁

，王蒂

1,2

，张俊莲

1,2

，司怀军

，

，柳娜

1 甘肃农业大学农学院，兰州（730070）

2 甘肃省作物遗传改良与种质创新重点实验室，兰州（730070）

3 甘肃农业大学生命科学技术学院，兰州（730070）

E-mail

：

wangd@gsau.edu.cn

摘要：在 NaCl 浓度 0，3.0，6.0 g/L 下，对转甜菜碱醛脱氢酶（BADH）基因马铃薯无性

繁殖二代的 4 个株系 GN-1，GN-2，GN-3，GN-4 及其受体亲本甘农薯 2 号（GN-CK）的盆

栽植株进行 PCR 检测及耐盐性试验。结果表明：BADH 基因在转基因马铃薯中具有遗传稳

定性，而且转 BADH 基因马铃薯比其受体亲本耐盐性强，在较高 NaCl 浓度（6.0 g/L）胁迫

下，BADH 基因可以提高马铃薯植株过氧化氢酶（CAT）活性，提高叶绿素含量，稳定细

胞膜的透性，降低植株体内丙二醛（MDA）含量，从而减轻受盐害的程度。

关键词：马铃薯；BADH 基因；盐胁迫；生理指标

在植物体内，甜菜碱由胆碱经两步氧化生成，即

（CH

）

OH ⎯⎯→⎯

CMO

（CH

）

CHO ⎯⎯→⎯

BADH

(CH

)

COO

胆碱甜菜碱醛甜菜碱

催化第一步反应的酶是胆碱单氧化物酶（Choline monooxygenase, CMO），催化第二步

反应的是甜菜碱醛脱氢酶（Betaine aldehyde dehydrogenase, BADH）。20 世纪 80 年代以来，

人们对 CMO 和 BADH 的理化性质进行了较为系统的研究。从 90 年代初开始，又对编码这

两个酶的基因进行了研究，其中对 CMO 基因的研究较少，而对 BADH 基因则作了大量研

究。BADH 基因是高等植物中甜菜碱生物合成的关键酶之一，酶学编号为 EC.1.2.1.8。

关于 BADH 基因工程研究较多。1990 年，Weretilnyk 等首次成功的克隆了菠菜的 BADH

cDNA

[1]

。1994 年，Rathinasabapathi 等将菠菜和甜菜 BADH 基因转入烟草，尽管此基因没

有典型的转导肽，但是 BADH 仍在转基因植物叶子的叶绿体中得到表达

[2]

。1995 年，肖岗

等又从盐生植物山菠菜中克隆了 BADH cDNA，并在 E.coli 中表达

[3]

。1997 年，郭岩等运用

基因枪技术将含 BADH cDNA 的植物双元表达载体转到水稻中，获得的转基因水稻有较高

的耐盐性，己在盐田中结实。这一成果在国际上首次报道，这是将植物来源的 BADH 基因

导入单子叶植物提高其耐盐性的首次尝试

[4]

。1997 年，梁峥等将菠菜 BADH 基因转入烟草，

获得正常表达，在叶绿体和胞液中均有 BADH 存在且具有活性

[5]

。1997 年，刘风华等用山

菠菜 BADH 基因转化草霉、烟草，亦获得良好的耐盐植株

[6]

。此外，人们已陆续将山菠菜

BADH 基因导入小麦

[7]

、豆瓣菜

[8]

，获得的转基因植株抗盐性都有一定程度的增强。

以上实验都证明BADH 基因转入能提高植物的耐逆性。鉴于此原理，针对马铃薯是水

分敏感型作物，且自身不能合成甜菜碱，如果从抗渗透能力强的植物中克隆合成甜菜碱的关

键酶基因CMO与BADH，通过基因工程手段将其转入马铃薯，诱导其内甜菜碱的超量表达，

以及对水分亏缺做出调节反应，将有望培育出抗旱、耐盐性强的马铃薯新品种。2004年，张

宁用菠菜BADH基因转化马铃薯，获得耐盐植株

[9]

。本研究选用转BADH基因马铃薯无性繁

殖二代的4个株系及其受体亲本甘农薯2号为供试材料，进行PCR检测及耐盐性的初步鉴定，

旨在探讨盐胁迫下转BADH基因马铃薯与其受体亲本的耐盐性差异，为耐盐品系的筛选提供

理论依据。

本课题得到高等学校博士学科点专项科研基金项目（20050733003）和甘肃省农业生物技术研究与应用开

发项目（GNSW-2006-01）得资助。。

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1. 材料和方法

1.1 供试材料

转BADH基因马铃薯无性繁殖二代4个株系GN-1，GN-2，GN-3，GN-4及其受体亲本甘

农薯2号（GN-CK），由甘肃省作物遗传改良与种质创新重点实验室提供。

1.2 田间试验

供试材料选取大小均一的薯块，用蛭石在防虫网中盆栽，生长期间进行盐胁迫处理及合

理的水肥浇灌。设置3个NaCl处理浓度：0g/L，3.0g/L，6.0 g/L。根据不同处理浓度将试验地

划分为三个小区：一区（0 g/L NaCl浓度），二区（3.0 g/L NaCl浓度），三区（6.0 g/L NaCl

浓度）。各小区下每个材料种3盆，每盆种2株，重复3次，随机排列。盐胁迫前，2-3天浇一

次清水，每次浇水2 L/盆；盐胁迫开始后，每天浇一次盐溶液，每次浇灌500 ml/盆，一区以

清水为对照。盐胁迫期间，盆下加塑料小盘，循环浇灌下渗液保证盐浓度平衡，防虫网加遮

塑料薄膜防雨，加遮阳网防强光。整个生长期间，每7 d 浇250 ml营养液，营养液配方:1升

水中含有MS培养基中的大量、微量元素和铁盐,并添加20 g磷二胺。

1.3 转基因植株的 PCR 检测

盐胁迫期间，不同株系随机采取叶片，按王关林等

[10]

的方法提取植物总DNA，以张宁

副教授提供的BADH基因的2个引物：5′-TTTCTTCGCATTTAACCAAG-3′和

5′-CTTAACAAAAACAACACCGT-3′进行PCR扩增，预期扩增片段大小为1556 bp。扩增

反应体积为20 µl，包括1 µl cDNA模板，2 µl 10×buffer，2 µl dNTPs（2 mmol/L），2 µl MgCl

，

1 µl 引物１（10 µmol/L），1 µl 引物2（10 µmol/L），1 µl Taq DNA聚合酶（1 U/µl），10 µl

ddH

O。扩增条件为：94℃预变性3 min，94℃，30 s；52℃，35 s；72℃，2 min；35个循环

后于72℃保温延伸10 min。扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.4 转基因植株的耐盐性鉴定

盐胁迫20 d后取样，测定丙二醛含量、叶绿素含量、细胞膜透性、CAT活性。盐胁迫2

个月后进行耐盐性性状观察。

1.4.1 丙二醛含量的测定

用TBA法

[11]

ULTRASPEC 1100 pro型紫外分光光度计测定

1.4.2 叶绿素含量的测定

用丙酮比色法测定

[11]

1.4.3 细胞膜透性的测定

用紫外吸收法

[11]

ULTRASPEC 1100 pro 型紫外分光光度计测定。

1.4.4 CAT 活性的测定

用紫外吸收法

[11]

ULTRASPEC 1100 pro型紫外分光光度计测定

1.5 统计分析

应用唐启义研制的计算机 DPS 数据处理统计分析软件进行方差分析

[12]

。

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