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通过对100 mg/L镉(Cd)溶液和蒸馏水培养下的蓖麻幼苗mRNA差异显示的前期研究,结果表明:采用百泰克公司生产的通用植物总RNA提取试剂盒能有效地提取蓖麻叶片总RNA ,通过3′端锚定引物与随机引物构成的引物对cDNA的PCR扩增,其产物的凝胶电泳共获得11条差异条带,均出现在Cd胁迫下的蓖麻中,说明100 mg/L Cd处理的蓖麻叶片在mRNA水平上发生了明显的变化,可能激发了与Cd耐性和积累相关基因的表达,其产物可能与缓解Cd对蓖麻造成伤害有关。对差异片段的进一步测序、克隆等研究,有助于蓖麻Cd
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云南农业大学学报 Journal of Yunnan Agricultural University ,2013 ,28 (5) :682 - 686 http ://xb畅
y
nau畅edu畅cn
ISSN 1004 - 390X ;CODEN YNDXAX E‐mail : xb@
y
nau畅edu畅cn
收稿日期 :2012 - 05 - 05 修回日期 : 2013 - 05 - 29 网络出版时间 :2013 - 08 - 08 15 ∶36
倡 基金项 目 : 云 南 省 教 育 厅 科 学 研 究 基 金 项 目 (2010Y073) ; 云 南 省 环 境 工 程 创 新 人 才 联 合 培 养 地 项 目
(A3003015) ;鲁地拉水电站土地评价项目 (fKX1320511) 。
作者简介 : 刘义富 (1969 - ) ,男 ,安徽安庆人 ,博士 ,讲师 ,从事植物遗传育种和品质改良研究 。
E‐mail : l _
y
ifu@ 163畅com
倡 倡 通信作者Corresponding author :毛昆明 (1947 - ) ,男 ,云南昆明人 , 教授 , 博士生导师 ,主要从事土壤发生发
展及土壤肥力演变研究 、 土地利用评价与管理研究 。 E‐mail : mkm7748@
y
nau畅edu畅cn
网络出版地址 : http : //www畅cnki畅 net/kcms/detail/53畅1044畅 S畅20130808畅1536畅201305畅682 _012畅 html
DOI :10畅3969/
j
畅issn畅1004 - 390X (n) 畅2013畅05畅012
镉 胁 迫 下 蓖 麻 相 关 基 因 表 达 的 mRNA 差 异 显 示
倡
刘义富
1 ,2
,毛昆明
2 倡 倡
(1畅 丽江师范高等专科学校 生命科学系 ,云南 丽江 674100 ;2畅 云南农业大学 资源与环境学院 ,云南 昆明 650201)
摘要 : 通过对 100 mg /L 镉 (Cd) 溶液和蒸馏水培养下的蓖麻幼苗 mRNA 差异显示的前期研究 ,结果表明 :
采用百泰克公司生产的通用植物总 RNA 提取试剂盒能有效地提取蓖麻叶片总 RNA , 通过 3′端锚定引物与随
机引物构成的引物对 cDNA 的 PCR 扩增 ,其产物的凝胶电泳共获得 11 条差异条带 ,均出现在 Cd 胁迫下的蓖
麻中 ,说明 100 mg /L Cd 处理的蓖麻叶片在 mRNA 水平上发生了明显的变化 , 可能激发了与 Cd 耐性和积累
相关基因的表达 ,其产物可能与缓解 Cd 对蓖麻造成伤害有关 。 对差异片段的进一步测序 、 克隆等研究 ,有助
于蓖麻 Cd 耐性和积累的分子机制研究 。
关键词 : 蓖麻 ; mRNA 差异显示 ;镉胁迫
中图分类号 : X 503畅231 文献标志码 : A 文章编号 : 1004 - 390X (2013) 05 - 0682 - 05
mRNA Differential Display of Ricinus communis L .Gene
Expression Related to Cadmium Stress
LIU Yifu
1 ,2
,MAO Kunming
2
(1畅Department of Life Sciences ,Lijiang Teachers College ,Lijiang 674100 ,China ;
2畅College of Resources and Environment Science ,Yunnan Agricultural University ,Kunming 650201 ,China)
Abstract : In this paper ,the difference of cadmium (Cd) resistance and accumulation related
g
enes fragments were investigated by using mRNA differential display technology in Ricinus
communis L .,which treated by 100 mg/L Cd (treatment) and distilled water (CK ) ,respec‐
tively .The results showed that total RNA was effectively extracted from the leaf use RNA Iso‐
lating Reagent Kit produced by Bioteke Corporation .Altogether 11 differential bands were only
obtained in the treatment by PCR which amplified with random constitution between 3′ an‐
chored primers and random primers .This indicated that the gene expression in mRNA of R .
communis L .could be changed by 100 mg/L Cd .It is mainly due to that changed expression
p
roduct could reduce the damage from Cd .The results can be reference for studies of the mo‐
lecular mechanism of cadmium tolerance and accumulation .
Key words : Ricinus communis L .; mRNA differential display ; Cd stresss
环境镉 (Cd) 污染事件的相继发生 , 引起了 国内外对 Cd 污染土壤的诊断和治理的广泛重视 。
在众多的修复技术中 , 植物修复技术以其成本低 、
见效快 、 无副作用 、 原位修复等特点 , 逐渐成为
Cd 污染土壤治理的前沿技术
[1 - 4]
。 研究人员发现
宝山堇菜
[5]
、 圆锥南芥
[6]
、 龙葵
[7]
、 蒌蒿
[8]
、 商
陆
[9]
、 东南景天
[10 ]
、 遏蓝菜
[11]
、 叶用红菾菜
[12]
、
长柔毛委陵菜
[13 ]
、 印度芥菜
[14]
、 垂柳
[15 ]
、 籽粒
苋
[16]
、 香根草
[17]
、 滇苦菜
[18]
、 鱼腥草
[19]
、 麻疯
树
[20]
、 壶瓶碎米荠
[21]
、 野茼蒿
[22 ]
等植物具有 Cd
污染修复的能力或潜力 , 但它们的生物量不大或
生长周期过长 , 适应范围有限 , 因此难以真正用
于大田实际修复 。 现代生物技术的发展 , 特别是
基因工程技术 , 为选育生物量大 、 生长周期短的
Cd 富集植物 , 使植物修复技术快速进入工程应用
提供了可能 。 在众多的生物技术中 , mRNA 差异
显示技术是一种快速有效克隆差异表达基因的技
术 ,广泛应用于生物逆境胁迫相关基因差异表达
的研究
[23 - 29 ]
。 已有报道应用 mRNA 差异显示技
术找到与 Cd 富集和耐性相关的基因
[30]
。
研究表明
[31 - 32 ]
,蓖麻具有很强的 Cd 污染耐
性和较强的 Cd 吸收积累能力 , 其 Cd 耐性也存在
明显的种间差异 。 因此可推测在 Cd 积累特性和
耐性方面蓖麻可能具有特殊的遗传机制 , 存在专
一的编码基因或诱导表达基因 。 本文应用 mRNA
差异显示技术研究蓖麻在 Cd 胁迫下基因表达的
差异片段 ,为克隆全基因片段提供前期基础 , 并
为蓖麻抗耐 Cd 分子机理提供参考 。
1 材料与方法
1畅1 叶片总 RNA 的提取及反转录
蓖麻幼苗经 100 mg/L Cd 溶液和蒸馏水水培
72 h 后分别取幼嫩叶片 100 mg , 应用百泰克生物
技术有限公司的通用植物总 RNA 提取试剂盒提
取 RNA ,以 BESTBIO 公司的 RT‐PCR 试剂盒进
行反转录和 PCR 扩增 , 用 3 条 3′锚定引物和百泰
克公司合成的 10 条随机引物构成引物对 , 进行
30 组 PCR 反应 .引物序列如下 :
5′端引物序列 (Sequence) :
1畅 GCGCATCAGC ;
2畅 GATCT TGATC ;
3畅 GATCTCGT TC ;
4畅 GATCAAGTGC ;
5畅 AAACTCCGTG ;
6畅 TACAACGAGC ;
7畅 GT TCAATCGC ;
8畅 GT TCCGCCCC ;
9畅 AAGAGCCCGT ;
10畅 GTAOCTGACG 。
3′端引物序列 (Sequence) :
I .5′ - AAGCT T T T T T T T TTA - 3′ ;
II .5′ - AAGCT T T T T T T T T TC - 3′ ;
III .5′ - AAGCT T T T T T T T T TG - 3′ 。
1畅2 方法
1畅2畅 1 总 RNA 提取
(1) 器具处理和溶液配制
实验室用的普通器皿 (研钵 、 镊子 、 药勺等)
使用前经 180 ℃ 烘烤 4 h , 塑料仪器用 0畅1% 的
DEPC 的 H
2
O 在 37 ℃ 浸泡过夜 ,然后用灭菌水淋
洗数次 , 并高压灭菌 2 次 。 RNA 电泳使专用电泳
槽 ,电泳槽使用前去污剂洗干净 , 再用无 RNA
酶的水冲洗 , 乙醇干燥 , 然后灌满 3% 的 H
2
O ,
室温放置 10 min 后 , 用 0畅1% DEPC 处理过的水
彻底冲洗后使用 。 提取 RNA 的所有溶液都使用
无 RNA 酶的 H
2
O 配制 , 然后高压灭菌 。
(2) RNA 提取步骤
a .匀浆处理 :取 100 mg 植物组织于液氮中研
磨 ,时间要短 , 要保持研钵内有液氮 ; b .转移样
品至 1畅5 mL RNase free 离心管中 ,加入 1 mL 的
裂解液 PL 颠倒混匀 , 在 65 ℃ 条件下孵育 5 min
以使核蛋白体完全分解 ; c .4 ℃ 的条件下 12 000
r/min 离心 10 min , 小心取上清液转入一个新的
RNasefree 过滤柱中 ; d . 10 000 r/min 离心 45 s 。
收集下滤液 (含有总 RNA ) 于收集管中 , 进行下
一步操作 ; e .在收集管中加入 1 倍体积 70% 的乙
醇 ,混匀 。 得到的溶液和可能沉淀一起转入吸附
柱 RA 中 (吸附柱套在收集管内 ) ; f . 10 000 r/
min 离心 45 s , 弃掉废液 , 将吸附柱重新套回收
集管 ;
g
.加 500
μ
L 去蛋白液 RE ,12 000 r/min
离心 45 s , 弃掉废液 ; h .加入 700 漂洗液 RW ,
12 000 r/min 离心 60 s , 弃掉废液 ; i .加入 500 漂
洗液 RW ,12 000 r/min 离心 60 s , 弃掉废液 ;
j
.
将吸附柱 RA 放回空收集管中 ,12 000 r/min 离心
2 min ; k .取出吸附柱 RA ,放入 1 个 RNase free
686
云南农业大学学报 第 28 卷
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苹果虾丸
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