荷包红鲤自噬相关基因LC3B的克隆及在重金属镉胁迫下的表达(2013年)资源-CSDN文库

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第 37卷第 6 期

2013年 12月

南昌大学学报（理科版）

Journal of Nanchang University (Natural Science)

Vol. 37 No . 6

Dec2013

文章编号：1006-0464(013)06-0570-07

荷包红鲤自噬相关基因LC3B的克隆及

在重金属镉胁迫下的表达

高典〃，隗黎丽 2 , 许珍娥 1b , 刘申 1 b , 乔盼盼 ib

( 1 南昌大学a.医学院；b.免疫与生物治疗研究所，江西南昌 330006;

2. 江西农业大学动物科学技术学院，江西南昌 330045)

摘要：微管相关蛋白1 轻链3(microtubule-associated protein 1 light chain 3 ，L C 3 )是哺乳动物细胞中酵母自職相

关基因8 C A T G 8 ) 的同源物，其 L C 3 B 亚型的表达强度与自噬泡数量的多少成正相关，为自噬发生的标志蛋白之一。

应用R A C E - P C R 技术克隆了婺源荷包红鲤L C 3 B 基因的c D N A 全长序列，用 R T - P C R 方法检测了该基因在荷包

红鲤主要组织中的表达，并用Real-tme quantitative P C R 方法检测了该基因在镉胁迫下转录水平的变化，以初步揭

示该基因在镉胁迫下的作用。结果表明，荷包红鲤L C 3 B 基因c D N A 全长为2 138 b p ，其中开放阅读框长378 b p ，

编码1 2 5 个氨基酸，预测分子量为14. 73 k D a ，等电点为8. 76 。序列比对显示，其编码的氨基酸序列和斑马鱼L C 3 B

具有最高的一致性和相似性，并在系统发育树上聚为一支。该基因在荷包红鲤肌肉、脑、鳃、脾脏、肝脏、血液、头

肾、肾脏和心脏组织中均有表达;在镉胁迫下，镉诱导显著影响了该基因在肾脏组织中的转录水平。L C 3 B 基因参

与的自噬反应可能参与了抗镉毒性作用。

关键词：微管相关蛋白1 轻链3; 自噬;镉；重金属；荷包红鲤

中图分类号：Q958.8 文献标志码：A

Molecular cloning，characterization and expression analysis of LC3B

from purse red common carp (Cyprinus carpio) exposed to cadmium

G A O D i a n la* , W E I Lilt , X U Z h e n e lh，L I U S h e n lh Q I A O P a n p a n lb

(1a. Medical College of Nanchang University，Nanchang 330006,China;

lb. Institute of Immunotherapy，Nanchang University, Nanchang 330006 ,China;

2. College of Animal Science and Technology，Jiangxi Agricultural University，Nanchang 330045，China)

Abstract ： L C 3 (microtubule-associated protein 1 light chain 3) , located in a u t o p h a g o s o m e m e m b r a n e s after

process ing ，serves as a majo r a u t o p h a g y marke r. In this s t u d y ，w e isolated i t s L C 3 B isform f r o m c o m m o n

carp (cyprinus carpio) ,o n e of the m o s t imp or tan t industrial aquatic animals i n C h i n a using rapid amplifica

tion of c D N A ends ( R A C E ) . T h e c D N A of L C 3 B g ene is 2138-nt in l engt h，containing a 378-nt o p e n read 

ing frame. T h e putative L C 3 B en co des a peptide of 125 a m i n o acids, w i th a calculated molecula r w e i g h t of

14. 73 k D a a n d an isoelectric point of 8. 76. Multiple se qu enc e alignment s h o w e d that the d e d uc e d a m i n o

acid sequenc e of c o m m o n carp L C 3 B h a d the highest seque nce identity (95. 2 % ) a n d similarity (96. 8 % ) to

that of zebrafish. In a phylogenetic tree b ase d o n a m i n o acid sequences f r o m fish , m a m m a lia n , a v i a n a n d a m 

phibian L C 3 genes, the L C 3 proteins f r o m different species w e r e divided into three s u b g r o u p s ( L C 3 A ，

L C 3 B a n d L C 3 C ) . T h e c o m m o n carp L C 3 B f o r m e d a phylogenetic cluster wit h zebrafish，the n other verte

brates. T h e m R N A transcript level of L C 3 B w a s detected in mus cle , brain, gills, spleen, liver, blood, h e ad

k idne y ,ki d ney a n d heart tissues b y R T - P C R analysis. L C 3 B m R N A transcript level in kidne y w a s found

收稿• 期：2013-09-30。

基金项目！国家自然科学基金项目（3 1 0 011 2 8 ) 江西省自然科学基金项目（2 n 0 G Q Y 0 2 0 9 );江西省科技支撑计划项目

(010 BSB0 3001 );江西省教育厅科学基金项目（GJJ1105 3) ;南昌大学（省级）创新创业训练计划项目

(201310403036)。

作者简介：高典（1979— ），男，博士，讲师。E-mail:gaodian@ncu. edu. cn。

第 6 期高典等：荷包红鲤自噬相关基因LC3B的克隆及在重金属镉胁迫下的表达 571 •

significantly elevated after exp o sur e to c a d m i u m . T h i s w a s m a r k e d l y affected b y e xpo s ure concentration，

；c o m m o n carp

not b y exp osu r e time.

K e y w o r d s ： L C 3 B ； a u t o p h a g y ； c a d m i u m ； h e a vy metal

自噬（a u t o p h a g y ) ，又称为细胞自我消化（cellu-

lar self-digestion)，是广泛存在于真核生物中的、依

赖细胞自身溶酶体以降解、清除、回收利用胞内大分

子和受损细胞器的生理病理过程[1]。根据胞内物质

转运到溶酶体内降解途径的不同，自噬可分为 3 种

类型 ••大自噬（m a c r o a u t o p h a g y )、分子伴侣介导的自

噬（c hape ron-me dia ted a u t o p h a g y ，C M A ) 和微自噬

( m i c r o a u t o p h a g y ) 。目前，对大自噬调节机制的研

究相对透彻，一般所说的自噬即为大自噬 [2]。在机

体正常的生长、发育条件下，细胞内自噬发生水肀较

低，在胞内物质的更新和维持内稳态方面起重要作

用[3];在受到饥饿、缺氧、高温、氧化损伤等外来压力

的胁迫时，自噬水¥ 显著上升，以减少外来刺激对机

体的损伤作用。

目前，在酵母和哺乳类的自噬发生过程中，约有

30 几种自噬相关基因 ( autophagy-related g e n e s ，

A T G s ) 参与了其中的调控作用。其中，微管相关蛋

白 1 轻链 3 [microtubule-associated protein 1 light

chain 3 ，L C 3 ; 酵母中名为 A T G 8 ]定位于前自噬泡

和自噬泡膜表面，调控微管蛋白的组装和去组装，参

与了自噬体的形成。L C 3 有 3 种亚型：L C 3 A 、

L C 3 B 和 L C 3 C 。但自噬水肀升高时，仅 L C 3 B 和增

加的自噬泡数目相关，因此 L C 3 B 亚型是自噬发生

的标志蛋白之一M 。

在激发机体产生自噬的因素中，重金属镉（c a d

m i u m ) 是一种重要的诱导剂[7]。镉广泛存在于土壤

和水体中，工业生产过程中如印染、冶金、电池生产

等可产生大量的镉污染M 。在分子、细胞水¥ ，镉胁

迫可阻碍线粒体的氧化磷酸化作用、抑制抗氧化酶

的活性、产生大量的活性氧、损伤 D N A 并抑制相关

的修复作用[Mn]。镉毒性效应和其作用的浓度、时

间及动物模型和细胞类型都有关系。一般认为低浓

度暴露（0. 5 ‘M ) 可促进细胞增殖、诱导细胞凋亡，

中等浓度暴露（10 ‘M ) 可激发细胞自噬，更高浓度

的镉（ 0 ‘M ) 可导致细胞坏死 [11 ]。中等水肀的自

噬可抑制凋亡性细胞死亡，更多自噬泡的产生则增

大了细胞毒性，导致细胞死亡[12]。

关于自噬在镉胁迫下的适应性保护作用机制，

在高等动物及其细胞内的研究已经取得一定进

展[7’13]。例如，在肾小球系膜细胞（M E S - 1 3 ) 中，镉

通过钙离子通道诱导了细胞自噬[1|];在肺上皮成纤

维细胞 ( R W I 3 8 ) 中，镉通过 p 3 8 激酶的激活诱导了

细胞自噬，促进了 A T G 5 和 L C 3 ' 表达水肀的上

升[13]。在鱼类、贝类等低等动物中，细胞自噬研究

刚刚开始，现有的报道集中于自噬在生长发育中的

必要作用角色和病理条件下的自噬相关基因表达的

检测等，自噬在抗重金属毒性方面的研究鲜有报

道[16]8]。婺源荷包红鲤鱼是鲤鱼一个重要的地方品

种，可作为许多鲤杂交品种的母本，具有较高的食

用、观赏和科学研究价值[19!|]，本研究以其为研究对

象，克隆了自噬发生的重要标志基因 L C 3 B ，并检测

了它在镉胁迫下的表达情况，以初步探索其在镉毒

害作用中的保护作用角色。

1 材料与方法

1. 1 材料

R N A 提取试剂盒 T R I z o l reagent 购自 Invitro-

g e n 公司，第一链 c D N A 合成试剂盒 S M A R T P C R

c D N A Synthesis Kit 购自 C lonte ch 公司，逆转录试

剂盒 R e v e r t A i d T M Fi r s t S t r a n d c D N A Synthesis

K i t 购自 F e r m e n t a s 公司，D N A 分子质量标准

( D L 2 0 0 0 ) 、S Y B R G r e e n Real-time P C R Ma s t e r

M i x 购自 T a k a r a 公司，镉 [3 ( C d S O 彳) . 8 H 2O ]购自

S i g m a 公司。

1 . 2 总 R N A 的提取

实验用鱼取自婺源荷包红鲤鱼研究所，实验室

静养 1 周后取肾脏组织 100 m g ，根据 T R I z o l 试剂

盒的说明书提取总 R N A 。

1 . 3 鲤 L C 3 B 全长 c D N A 序列的获得

1 . 3 . 1 鲤 L C 3 B 基因 c D N A 中间片段的获得根

据 S M A R T P C R c D N A Synthesis Kit 合成第一链

S M A R T c D N A 。根据已知的斑马鱼（D a n i o rerio，

G e n B a n k accession no. N M _ 1 9 9 6 0 4 . 1 ) ，非洲爪瞻

( X e w o p w s laevis，G e n B a n k accession no. N M _

001 0 95609 . 1 ) 和鸡（G aZZ ws gallus，G e n B a n k acces

sion no. N M _ 0 0 1 0 3 1 4 6 1 . 1 ) L C 3 B 基因的保守序列，

设计荷包红鲤 L C 3 B 基因的正、反向引物 L C 3 F 和

L C 3 R (表 1 ) ，并以 S M A R T c D N A 为模板，扩增鲤

L C 3 B 基因的 c D N A 中间片段。该 P C R 反应的扩

增参数是： 4 °C变性 5 m i n 后，94 E 40 s,62 E 40

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荷包红鲤自噬相关基因LC3B的克隆及在重金属镉胁迫下的表达 (2013年)

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