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报道水稻黄单胞(Xantho monas oryzae)的两个致病变种(pv.oryzae和pv.oryzicola) 所产生的Harpin蛋白。结果表明,表达菌株HRF1和HRF2分别携带两个致病变种编码Harpin的hrf1和hrf2基因。在IPTG诱导下,两个表达菌株的无细胞破碎液均具有激发烟草叶片过敏反应(HR)的活性。采用(NH4)2SO4沉淀、阴离子交换层析、Native-PAGE微量制备等方法,分别纯化出分子量为15600和15300,pI皆为4.5左右的单一条带;这两个单一组分符合典型Ha
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Vol.27 高等学校化学学报 No.5
2006年5月
CHEMICALJOURNALOFCHINESEUNIVERSITIES 875~879
新型水稻黄单胞菌 Harpin蛋白的纯化
及其特性研究
陆徐忠, 王金生
(南京农业大学植物保护系农业部病虫监测与治理重点开放实验室, 南京 210095)
摘要 报道水稻黄单胞( Xanthom onas oryzae) 的 两个致 病变种 ( pv.oryzae 和 pv.oryzicola) 所产 生的 H arp in 蛋
白. 结果表明, 表达菌株 H R F1 和 H R F2 分别携带两个致病变种编码 H arpin 的 hrf1 和 hrf2 基因. 在 IPTG 诱
导下, 两个表达菌株的无细胞破碎液均具有激发烟草叶片过敏反应(H R )的活性. 采用(N H
4
)
2
SO
4
沉淀、阴
离子交换层析、N ative-PAG E 微量制备等方法, 分别纯化出分子量为 15 600 和 15 300, pI皆为 4.5 左右的单
一条带; 这两个单一组分符合典型 H arpin 蛋白的特征: 可激发烟草 H R, 诱导烟草抗 TM V , 对蛋白酶 K 敏
感、对热稳定; 放线菌素 D 、环己酰亚胺和氯化镧等真核生物代谢抑制剂可消除它们的生物活性; 琼脂双扩
散试验(ODD )血清反应表明, 两个 H arpin 蛋白有交叉反应.
关键词 H arpin 蛋白; 水稻黄单胞; 致病变种; 纯化; 生物特性
中图分类号 Q943.2; S476.1 文献标识码 A 文章编号 0251-0790(2006)05-0875-0
5
收稿日期: 2005-04-05.
基金项目: 国家重点基础研究发展规划(批准号: G2000016201)、国家自然科学基金(批准号: 30230240)和南京市科技计划项目
(批准号: 2002ZB0114)资助.
联系 人简 介: 王 金生 (1939 年 出生 ), 男, 教授, 从 事 分 子 植 物 病 理 学 研 究 . E -m ail: w angjsh@ njau.edu.cn
植物过敏性反应(H R )是一种植物局部细胞的快速死亡过程, 分别由病原菌无毒基因 avr编码的特
异性激发子 A VR 及 hrp 编码的非特异性激发子 H arpin 引起
[1]
.Harpin
Ea
是从 E . am ylovora 中鉴定的第
一个 hrp 基因编码产物, 由 hrpN 基因编码, 分子量为 4 400, 富含甘氨酸, 缺乏半胱氨酸, 对热稳定,
对蛋白酶 K 敏感, 对紫外光敏感, 能在非寄主植物上诱导过敏反应
[2]
. 此后相继从 Erwinia 等其它革
兰氏阴性菌中鉴定出编码激发 H R 激发子的基因及它们的产物 Harpin
[3 ~5]
.朱伟光等
[3]
通过基因文库
互补, 从黄单胞植物病原细菌(Xanthom onas)中克隆到一个 hrp 相关基因 hpa1(hrp-associated gene),定
位于 hrpA 操纵子之前. 推测该基因的产物是分子量约为 13 000 的富含甘氨酸的蛋白质, 与 H arpin 和
PopA 1的组分类似.
本实验室已从水稻白叶枯病菌株 JX O Ⅲ和水稻细条斑病菌株 R S105 中分别克隆到引起烟草过敏性
反应激发子的编码基因 hrf1 和 hrf2, 前者编码蛋白质(Harpin
Xoo
)的全长为 140 个氨基酸, 分子量为 15
600; 后者编码蛋白质(H arpin
Xooc
)的全长为 138 个氨基酸, 分子量为 15 300. 初步证明它们表达产物的
粗提物具有诱导植物过敏反应和系统获得抗性能力
[4 ]
.
本文对 H arpin
Xoo
和Harpin
Xooc
进行进一步研究, 在纯化产物基础上进行定性和定量分析, 为深入研
究 H arpin 蛋白的结构和生产应用的质量控制提供依据.
1 实验部分
1.1 仪器与材料
A K TA Explorer100 层析装置(瑞典安玛西亚); Edward 真空冷冻浓缩仪(英国); M ultiphor II Elec-
trophesis system 等电焦系统(瑞典 LK B); D YY III28B 垂直板电泳系统(北京六一仪器厂).
表达菌株 BLH R414 [BL21 /pET30a( + ) ∷hrf1] (K am
r
40 μg/m L)携带水稻白叶枯菌(X. o. pv.
oryzae) 编 码 H arpin
Xoo
的 hrf1 基因(简称 H RF1), 表达菌株 BLH R4 [pET30a( + ) ∷hrf2] (Kam
r
40
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