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CRISPR-Cas9体系实验流程(2).pdf
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2021-09-26
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CRISPR-Cas9体系实验流程(2).pdf
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一、材料试剂准备
1) 质粒:
pSpCas9(BB)-2A-GFP (Addgene plasmid ID: 48138),用于转染 cas9,该质粒
含有 Cas9与GFP,Cas9的nickase活性将用于特定目的基因的 ko,GFP可做为
转染标签。
pSpCas9(BB) (Addgene plasmid ID: 42230),若实验用 sgRNA为PCR扩增纯化
产物,则需要该质粒做为 U6的模版。
pUC19(Invitrogen, cat.no.15364-011)可用于构建 sgRNA,若用 PCR产物进行
转染,则需要该质粒来进行共转染,做为 DNA carrier。
上述三种质粒, 根据实验选择 sgRNA的表达方式 (PCR产物 / 单载体系统 / 双
载体系统)来确定具体使用哪种。
2) 超纯水, DNase/RNase-free (Life Technologies, cat. no. 10977-023)
3) 高保真聚合酶, Kapa HiFi (Kapa Biosystems), PfuUltra (Agilen) ,Herculase II
fusion polymerase 均可,只需保真效果好,扩增过程不产生突变。
4) Taq DNA polymerase with standard Taq buffer (NEB, cat. no. M0273S)用于一
般检测。
5) QIAquick gel extraction kit (Qiagen, cat. no. 28704)
6) QIAprep spin miniprep kit (Qiagen, cat. no. 27106)
7) Fast Digest BbsI (BpiI) (Fermentas/Thermo Scientific, cat. no. FD1014),如需要
将sgRNA构建到 pSpCas9(BB)-2A-GFP质粒上,则需要该酶。
8) T7 DNA ligase with 2 × rapid ligation buffer (Enzymatics, cat. no. L602L). 或者
T4 DNA ligase,二者无区别。
9) Stbl3 chemically competent E. coli (Life Technologies, cat. no. C7373-03)
10)dNTP solution mix, 25 mM each (Enzymatics, cat. no. N205L)
11) MgCl2, 25 mM (Thermo Scientific, cat. no. R0971)
12) T4 polynucleotide kinase (New England BioLabs, cat. no. M0201S)
13) Plasmid Safe ATP-dependent DNase (Epicentre, cat. no. E3101K)
14) Adenosine 5 ′-triphosphate, 10 mM (New England BioLabs, cat. no. P0756S)
15)SOC medium (New England BioLabs, cat. no. B9020S)
二、实验流程
1)确定 target site。 根据CRISPR在线设计工具 http://crispr.mit.edu/设计
sgRNA,(还有其他设计工具,推荐该软件)。将目的基因 250bp以内的核苷酸
序列输入,避免内含子,约 10min将会给出备选的 target site。
或者人工手动选择,在目的区域 5′-NGG(即 PAM )上游 20bp片段均可做为
target site,一般 target site可选在正义链或者反义链,二者均可。
2) 准备 sgRNA表达体系 。 三种方案可选: a, 直接使用 PCR扩增纯化产物,
该产物片段含有 U6+sgRNA,约370bp; b, 将sgRNA载体构建到
pSpCas9(BB)-2A-GFPpUC19质粒当中,即单载体系统; c, sgRNA载体构建到构
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