CRISPR-Cas9体系实验流程(2).pdf

CRISPR-Cas9 体系实验流程 本文主要介绍 CRISPR-Cas9 体系实验流程，涵盖实验准备、实验流程、质粒 preparation、PCR 扩增、sgRNA 表达体系的构建等多个方面。 实验准备 在进行 CRISPR-Cas9 实验之前，需要准备相关的试剂和质粒。这些试剂和质粒包括： 1. 质粒：pSpCas9(BB)-2A-GFP、pSpCas9(BB)、pUC19 等，用于转染 Cas9 和表达 sgRNA。 2. 超纯水：DNase/RNase-free，用于实验中所有的步骤。 3. 高保真聚合酶：Kapa HiFi、PfuUltra、Herculase II fusion polymerase 等，用于 PCR 扩增。 4. Taq DNA polymerase：用于一般检测。 5. QIAquick gel extraction kit：用于agarose凝胶电泳后的 DNA纯化。 6. QIAprep spin miniprep kit：用于质粒 DNA 的提取和纯化。 7. Fast Digest BbsI (BpiI)：用于将 sgRNA 构建到 pSpCas9(BB)-2A-GFP 质粒上。 8. T7 DNA ligase 或 T4 DNA ligase：用于 DNA 连接反应。 9. Stbl3 chemically competent E. coli：用于质粒的转化。 10. dNTP solution mix：用于 PCR 反应。 11. MgCl2：用于 PCR 反应。 12. T4 polynucleotide kinase：用于 ATP 依赖的 DNA 连接反应。 13. Plasmid Safe ATP-dependent DNase：用于去除质粒中的非特异性结合位点。 14. Adenosine 5′-triphosphate：用于 ATP 依赖的 DNA 连接反应。 15. SOC medium：用于细菌的生长和选择。 实验流程 实验流程主要包括两个部分：确定 target site 和准备 sgRNA 表达体系。 确定 target site 1. 使用 CRISPR 在线设计工具（http://crispr.mit.edu/）设计 sgRNA，输入目的基因 250bp 以内的核苷酸序列，避免内含子。约 10min 将会给出备选的 target site。 2. 或者人工手动选择，在目的区域 5′-NGG（即 PAM）上游 20bp 片段均可作为 target site。一般 target site 可选在正义链或者反义链，二者均可。 准备 sgRNA 表达体系 有三种方案可选： a. 直接使用 PCR 扩增纯化产物，该产物片段含有 U6+sgRNA，约 370bp。 b. 将 sgRNA 载体构建到 pSpCas9(BB)-2A-GFP 质粒当中，即单载体系统。 c. sgRNA 载体构建到 pUC19 质粒当中，成为双载体系统。 PCR 扩增 PCR 系统如下： U6-Fwd: GAGGGCCTATTTCCCATGATTCC U6-Rev:AAAAAAAGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTCAAGTTGATAACGGACTAGCCTTATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAAcNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCCGGTGTTTCGTCCTTTCCACAAG 其中聚合酶也可以使用 pfu 或者 Kapa Hifi 代替，高保真效果好，扩增过程不产生突变。 本文详细介绍了 CRISPR-Cas9 体系实验流程，包括实验准备、实验流程、质粒 preparation、PCR 扩增、sgRNA 表达体系的构建等多个方面，为研究人员提供了详细的实验指导。