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基因工程中限制酶的选择及的筛选方法
摘要:基因工程是现代生物科技专题的重要内容,基因工程四部曲中的核心内容是基因表达
载体的构建,在构建表达载体过程涉及的限制酶的种类以及筛选方法成为考试的热点内容。
本文结合三道例题将限制酶的选择和筛选方法结合在一起进行比较分析。
关键词:限制酶 筛选
1 单酶切及筛选
若用同一种限制酶切割质粒和目的基因形成相同的四个黏性末端,因而可能出现多种连接方
式如①质粒和质粒②目的基因和目的基因③质粒的自身环化,目的基因的自身连接④质粒与
目的基因的连接。质粒与目的基因的连接又会出现正向连接和反向连接两种。若启动子在质
粒上,目的基因与质粒的反向连接则导致三联体密码顺序改变,起始密码子和终止密码子位
置改变,使得翻译不能正常进行而无法得到正常的表达产物。
例 1: (2012 江苏生物高考 33 题部分)图 2 表示一种质粒的结构和部分碱基序列。现有 Msp I、
BamH I、Mbo I、Sma I4 种限制性核酸内切酶,它们识别的碱基序列和酶切位点分别为
C
↓
CGG、G
↓
GATCC、
↓
GATC、CCC
↓
GGG。请回答下列问题
若将图 2 中质粒和目的基因 D 通过同种限制酶处理后进行连接,形成重组质粒,那么应选
用的限制酶是 。在导入重组质粒后,为了筛选出含重组质粒的大肠杆菌,一般需要用添加
的培养基进行培养。经检测,部分含有重组质粒的大肠杆菌菌株中目的基因 D 不能正确
表达,其最可能的原因是 。答案: BamH I 抗生素 B 同种限制酶切割形成的末端相同,
部分目的基因 D 与质粒反向链接
笔者认为可通过免疫学方法检测目的基因的表达产物排除反向连接的重组质粒,或分别在质
粒和目的基因上设计相同的限制酶识别位点,然后用该酶去切割重组质粒,正向连接和反向
连接便会得到不同长度的 DNA 片段,再根据已知的限制酶在目的基因的位置进行比对,找
到正确连接的重组质粒。
2 双酶切及筛选
因为用单酶切会出现质粒与目的基因的任意连接,所以在实际操作中多使用双酶切。双酶切
可以避免质粒的自身环化,目的基因的自身连接和目的基因和质粒的反向连接,而目的基因
与目的基因的连接因为没有抗生素抗性基因所以可以在含有该抗生素的培养基上去除,故只
剩下质粒与质粒,以及质粒与目的基因的重组体。
2.1 插入失活筛选法
例 2:(苏锡常镇 2012 届高三教学调研测试)MseI,EcoRI,PstI 识别的碱基序列和切割位
点分别为 GAAT
↓
TAATTC,G
↓
AATTC,C
↓
TGCAG。请回答下列问题: