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ISHprotocol荧光原位杂交技术实验方案.pdf
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2022-07-14
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ISHprotocol荧光原位杂交技术实验方案.pdf
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地高辛标记寡核苷酸,荧光标记二抗, ISH,冰冻切片操作过程:
1、 多甲固定:应尽量在半个小时内完成。(固定时间以 24-36 小时为宜,避免 RNA
降解或固定过度。)
2、 切片 :为获得高杂交信号,冰冻切片应切成 10um-20um。(选用 16um)(切好的片
子可以保存在 -70 度中)但是要注意,保存在 -70 度中的切片,拿出来以后,立即在
4%的多甲中重新固定,避免在重新固定前切片恢复室温。(重新固定 10-15min)
3、 用 0.1MPB 洗切片 3*5min
4、 切片放入 100%乙醇 5min,空气中干燥。
杂交液:( 20ml) 藏于 -20 度
20*SSC 4ml
硫酸葡聚糖 4g
去离子甲酰胺 10ml
将他们溶解后,加入以下物质:
Poly A(10mg/ml) 0.5 ml
SsDNA(10mg/ml) 0.5 ml
tRNA (10mg/ml) 0.5 ml
DTT (1M) 2ml
50*Denhardts 0.2ml
上述溶液可以配置后长期贮藏与 -20 度中, 用前预热到 37度 。
杂交溶液:将地高辛加入杂交液中,探针的浓度需要摸索(一般是 100ng-1000ng/ml,
一般是以 200ng/ml 为起点来摸索条件),所加的杂交液的体积看切片的大小来决定,
对于 2cm*2cm 的组织,一般是加 50ul,但是对于嗅球,可能 30-40ul 足够。
加好杂交液以后,用盖玻片盖上切片(注意中间不要留有任何的气泡),为防止杂交
液从盖玻片中流走,注意使切片保持水平,并且注意切片不能干燥,(干燥的话杂交
会有一个很高的背景)
在湿盒中 37 度杂交 18小时,这个杂交时间可以延长到 40 小时来提高杂交的信号,但
是前提是不能让切片干燥。
杂交后处理 ;
制备 0.5*SSC 和 1*SSC(从 20*来稀释)并且保证这两种 SSC在使用的时候的温度是
55 度。
注意配置 0.5*SSC 和 1*SSC 中含有 10mM 的 DTT (将 1.2g的 DTT 加入到 800ml 的
SSC中)
杂交后,用小镊子将盖玻片轻轻移走,然后倒掉杂交液,将切片放入洗液中,在振摇
水浴 中按照下面的要求来洗片:
快洗: 1*SSC(10mMDTT)室温
2*15min:1*SSC(10mMDTT )55度
2*15min 0.5*SSC(10mMDTT) 55 度
1*10min 0.5*SSC(10mMDTT )室温
将切片一直放在最后一步的溶液中一直到下一步操作。
检测:
将切片转移到 TBS 缓冲液中( 100mM tris-HCl ,150mM NaCl,PH=7.5),将切片在
TBS 缓冲液中洗 3*5min ,
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