双分子荧光互补技术(BiFC)
一、技术简介
双分子荧光互补技术(BiFC)是一种直观、快速地判断目标蛋白在活细胞中的定位和相互作用的新技术。该技术是由Hu等在2002年最先报道的,利用荧光蛋白家族的特性,将荧光蛋白分割成两个不具有荧光活性的分子片段,再分别与目标蛋白连接。如果两个目标蛋白因为有相互作用而接近,就使得荧光蛋白的两个分子片段在空间上相互靠近,重新形成活性的荧光基因而发出荧光。
二、技术原理
BiFC技术的原理是基于荧光蛋白的结构特性。荧光蛋白的β片层之间的环结构(loop)上有许多特异位点可以插入外源蛋白而不影响荧光蛋白的荧光活性。通过将荧光蛋白分割成两个不具有荧光活性的分子片段,并分别与目标蛋白连接,当两个目标蛋白因为有相互作用而接近时,荧光蛋白的两个分子片段在空间上相互靠近,重新形成活性的荧光基因而发出荧光。
三、技术特点
BiFC技术具有以下几个特点:
1. 能在显微镜下直接观察到蛋白相互作用而且不依赖于其他次级效应。
2. 该相互作用可以在活细胞中进行观察,排除了由于细胞裂解或固定可能带来的假阳性结果。
3. 蛋白质在近似生理条件的环境下表达,表达水平及特性如翻译后修饰极大地接近于内源蛋白。
4. 不需要蛋白质有特别的理论配比,能检测到不同亚群蛋白质间的相互作用。
5. 多色BiFC技术不仅能同时检测到多种蛋白质复合体的形成,还能够对不同蛋白质间产生相互作用的强弱进行比较。
6. BiFC技术除了荧光倒置显微镜外,不要求特殊的设备。
四、实验步骤
1. 将目的基因插入到含有N片段或C片段的载体中,构建成融合蛋白表达载体。
2. 转染细胞,荧光显微镜下观察是否有相互作用。
五、应用实例
Fig1: Potassium deprivation increases BiFC signals formed by JunVN173 and ATF2VC155. CGNs were transfected with plasmids encoding JunVN173 (JunVN) and ATF2VC155 (ATF2VC) together with ECFP. JunΔL3VN were served as a control. After 16 hr, CGNs were switched to 25K, 5K media for 1h. Photos were taken on a fluorescence microscope at a magnification of 200× . The white arrows indicated the BiFC signals (Venus fluorescence). The transfected cells were lysed for Western blotting by anti-Flag and anti-ATF2 (20F1 CST). CFP were reprobed for normalizing the transfection efficiency. The percentage of CFP-positive cells exhibiting Venus fluorescence was scored.
六、技术优点
BiFC技术具有以下几个优点:
1. 能够检测到蛋白质相互作用的动态过程。
2. 能够检测到蛋白质相互作用的强弱。
3. 能够检测到蛋白质相互作用的时空特性。
4. 能够检测到蛋白质相互作用的细胞信号分子对其相互作用的影响。
5. 能够检测到蛋白质相互作用的细胞信号分子对其相互作用的影响。
七、技术局限
BiFC技术也存在一些局限:
1. 假阴性和假阳性结果的可能性。
2. 需要在实验中仔细验证。
3. 需要选择合适的荧光蛋白和目标蛋白。
八、结论
BiFC技术是一种非常有前途的技术,能够检测到蛋白质相互作用的动态过程,并且能够检测到蛋白质相互作用的强弱、时空特性、细胞信号分子对其相互作用的影响等。该技术的完善与发展必然会为蛋白质组学、蛋白质相互作用连锁图的建立带来福音。