论文研究 - 一种高灵敏度的检测方法，磷酸标记

蛋白质的磷酸化是重要的翻译后修饰。 确定蛋白质磷酸化状态的方法对于评估各种生物学过程非常重要。 CRK5是拟南芥中CDPK相关的蛋白激酶，根据Y2H结果，WD重复蛋白（WDRP）可能是CRK5相互作用蛋白。 在这里，我们使用双分子荧光互补（BiFC）进一步研究和可视化CRK5和WDRP在活细胞中的相互作用。 然后，我们使用WDRP抗体和抗6×His抗体将Phos-tagTM SDS-PAGE与Western blot（WB）分析相结合，以检测磷酸化的WDRP。 该方法证实WDRP可能在体外被CRK5磷酸化。 位点突变分析表明，丝氨酸70可能是WDRP中CRK5磷酸化的氨基酸。 从WT，OERK5和crk5分离的细胞提取物，用于分析以重组WDRP为底物的激酶反应。 这些结果表明WDRP被细胞提取物磷酸化，并且在拟南芥中可能还有其他激酶使WDRP磷酸化。 因此，Phos-tagTM SDS-PAGE为分析植物中的磷酸化提供了一种便捷的方法。