荧光定量PCR（Quantitative Polymerase Chain Reaction, qPCR）是一种广泛应用在生物学研究和医学诊断中的技术，主要用于检测和定量样本中的特定DNA序列。本文主要比较了三种荧光定量PCR的检测方法：染料法、探针法（包括水解探针和分子信标）以及双重杂交探针法。
1. **染料法**：
- 常用的染料如SYBR Green I，这种染料能与双链DNA结合并增强荧光。
- 检测原理是染料与双链DNA结合后荧光强度增强，进而反映DNA扩增的数量。
- 优点：通用性强，成本相对较低，适用于科研用途。
- 缺点：非特异性，无法区分目标序列与非特异性扩增，可能导致假阳性结果。
2. **水解探针法**：
- 探针上5'端标记荧光基团，3'端标记淬灭剂。
- 在PCR扩增过程中，如果探针与目标序列匹配，会被5'外切酶切开，荧光基团与淬灭剂分离，产生荧光。
- 优点：具有较高的特异性，能减少非特异性扩增的影响。
- 常见荧光基团如FAM、TET、HEX、CY5等。
- 扩增程序通常包括95℃预变性、55℃-60℃退火/延伸，重复多个循环。
3. **分子信标法**：
- 分子信标是具有茎环结构的探针，两端互补配对，荧光基团和淬灭剂靠近，形成非荧光状态。
- 当与目标序列结合时，分子信标线性化，荧光基团与淬灭剂分离，产生荧光。
- 特点：依赖于模板的存在与否来决定荧光信号，同样具有高特异性。
- 常用荧光基团如VIC、NED、PET、647等。
- 扩增程序通常包括95℃变性、55℃-60℃退火/延伸，重复多个循环。
4. **双重杂交探针法**：
- 由两条相邻的探针组成，分别标记不同荧光基团。
- 探针结合在模板上时，两个荧光基团靠近，产生荧光；当探针游离，荧光消失。
- 实时检测，信号非累积，具有高灵敏度和特异性。
- 常用荧光基团如FRET对，如FAM和TAMRA。
实验操作中应注意以下几点以确保实验质量：
- 试剂混匀后再使用，避免浓度不均。
- 移液枪使用后归位，保持弹簧弹性。
- 关闭水浴箱，避免能源浪费。
- 防止污染，如高温灭菌玻璃器皿，用无菌双蒸水配制试剂，使用一次性防护装备等。
- 使用有效的酶抑制剂，如焦磷酸二乙酯、异硫氰酸胍、氧钒核糖核苷复合物等，以防止酶活性的影响。
在选择荧光定量PCR方法时，应根据实验目的、样本特性、特异性和灵敏度要求以及实验室条件进行综合考虑。每种方法都有其优势和局限性，理解这些差异有助于优化实验设计，获得可靠的结果。
