primerExpress 说明书

### PrimerExpress 说明书：Real-time PCR 引物设计软件详细指南 #### 一、引言 PrimerExpress v3.0是一款专为实时聚合酶链式反应（Real-time PCR）设计引物和探针的软件工具。它通过自动化设计过程，帮助用户高效地创建高质量的引物和探针组合，适用于定量分析和等位基因判别实验。 #### 二、引物和探针设计准则 1. **引物和探针距离**：引物与探针之间的距离应尽可能接近，这有助于提高PCR产物的特异性和效率。理想的PCR产物大小应在50-150bp之间。 2. **GC含量**：引物的GC含量应保持在30%-80%，以确保稳定的退火温度和引物稳定性。 3. **重复序列避免**：设计时应避免出现重复序列，尤其是连续四个以上的G基，这可能会影响引物的性能。 4. **Tm值**： - 量化分析（Quantification assay）：68-70℃ - 等位基因判别分析（Allelic Discrimination assay）：65-67℃ - 一般情况下：58-60℃ 5. **探针长度**： - TaqMan MGB探针：13-25碱基对 - TaqMan探针：13-30碱基对 6. **引物长度**：建议为20个碱基对。 7. **避免特定序列**：避免连续六个A的序列出现，且引物5'端第一个碱基不应为G；如果使用FAM染料，则5'端第二个碱基也不应为G。 8. **选择富含C的探针**：在参数设置中可以选择富含C的链作为探针。 9. **避免G三联体**：避免探针3'端前四个碱基中包含三个或更多的G，如GGG-MGB-3'或GGAG-MGB-3'。 10. **避免CC二核苷酸**：避免探针中间区域含有两个或更多的CC二核苷酸。 11. **限制3'端C+G数量**：探针3'端前五个碱基中C+G的数量不应超过两个。 #### 三、使用PrimerExpress进行自动设计 1. **启动PrimerExpress v3.0**：打开软件后，通过File → New选择所需的分析类型，例如"TaqMan MGB Quantification"或"TaqMan Quantification"。 2. **添加序列文件**：通过Tools → Add DNA File导入待分析的序列文件。支持的文件格式包括.dan、.txt、.ab1、.abi。也可以在"Sequence"标签中直接粘贴或输入序列。 3. **双链显示选项**：勾选"Double Strand"可以查看双链DNA序列。 4. **排除和标记序列**： - 使用"Exclude Selected Bases"删除不必要的序列部分。 - 使用"Junction"标记已知的连接点，只需选择2个碱基范围并点击"Junction"。 5. **参数设置**："Parameters"标签提供了引物和探针Tm值的设定及其他设计规范。 6. **查找引物和探针**：在"Sequence"标签下，通过Tools → Find Primers/Probes启动搜索。软件将自动生成多达50种引物/探针组合，并在"Primers/Probes"标签中列出，展示它们在序列中的相对位置。 7. **选择和保存**：根据设计准则挑选最合适的引物/探针组合，然后通过File → Save As保存项目。如需单独保存选定的引物/探针集，使用Export功能导出。 通过遵循这些指南，PrimerExpress v3.0可以帮助用户快速、准确地设计用于实时PCR实验的引物和探针，极大地提高了实验的成功率和数据质量。