Primer Express Operation Guide
Primer Express v3.0
Primers and Probe Design For Real-Time PCR
Primer Express Operation Guide
2
Primers/Probes Design Guideline
TaqMan Probe Primer
Probe 與 Primer 的距離愈近愈好, PCR 產物大小建議在 50-150 bp 為最佳
G/C % 為 30-80 %
避免有重複序列的出現,尤其避免 4 個以上 G 的出現
Tm 值: 68-70℃ (Quantification assay)
65-67℃ (Allelic Discrimination assay)
Tm 值: 58-60℃
Probe 長度:
13~25 bases (TaqMan MGB probe)
13~30 bases (TaqMan probe)
Primer 長度:
20 bases (Optimal)
避免連續 6 個 A 的序列出現
5’端第一個序列不能為 G
(如果選擇 FAM-dye 在 5’端第二個序列也不能為 G)
選擇C比G多的strand當作probe
b
避免 3’端的前 4 個序列裡含有 3 個或以上 G
(GGG-MGB-3’ or GGAG-MGB-3’)
a
避免probe的中間區域含有 2 個或以上的CC di-nucleotides
a
3’端的前五個序列裡不能超過 2 個 C+G
a: 針對 TaqMan MGB probe
b: 參數可選擇設定
Primer Express Operation Guide
3
Primers & Probes for Quantification
Automatically Design
進入 Primer Express 3.0 軟體
File→ New→選擇“TaqMan MGB Quantification 或 TaqMan Quantification”→ OK
Tools →按 “Add DNA File” ,尋找序列存取位置,按下”Add”,將序列檔案加入空白文件。亦
可在”Sequence” Tab 中使用 Copy & Paste 轉貼或直接輸入序列。
* Primer Express Software 只能接受.dan, .txt, .ab1,或.abi 的檔案格式, 請事先將欲分析的序列存成純文字檔即
可(若序列是從 database download 下來時,請刪除與序列無關之資料)
Primer Express Operation Guide
4
可勾選” Double Strand “, 即會顯示 double stranded DNA sequence
Tools 上的選項
1. Exclude:不必要的序列可利用”Exclude Selected Bases” 將序列刪掉
- 先選取不要的序列範圍,點選 “Exclude”,即可看見此區域被劃掉
Primer Express Operation Guide
5
2. Junction: 如果已經知道序列上 junction 位置則可利用”Junction”
- 框選 juction 的位置(必須含 2 bases),再點選 “Junction”,即可看見此區域被紅色標
記起來。
3. 在”Parameters” Tab 中可看到 Primer/Probe Tm 值設定及其他 Primers/Probe 設計之規範