第11章-体外试验与新生物技术在毒理学中的应用.doc
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2021-10-11
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第八章 毒理学评价的分子生物学方法
分子毒理学固然应主要着眼于生物大分子，但也应当看到这些大分子是存在于细胞膜
上、细胞器，乃至细胞间隙液中的。它们与细胞是不可别离的。因此，对亚细胞组分的研
究也是毒理学分子生物学评价的重要组成局部。
第一节 亚细胞组分的制备
现代毒理学中使用最多的亚细胞组分是细胞膜、微粒体与线粒体。现就细胞膜、微粒体
与线粒体的制备方法加以介绍。
一、细胞膜的制备
细胞膜指细胞外层质膜，厚度约 6～10nm。它将细胞与外环境分隔，且参与细胞的生
命活动，细胞各种细胞器也是由质膜分隔，称为细胞器膜，两者统称为生物膜。它是常用
的研究模型，用以从细胞和亚细胞水平研究外源化合物的中毒机制。
1．肝细胞膜的制备
其根本原理是：首先，将肝组织在含有钙离子的低渗碳酸氢钠缓冲液中温和匀浆，使
细胞膜保持较大的膜片；其次，应用低速离心使细胞膜片与细胞核一起从匀浆中别离，再
利用细胞膜与细胞核之间的密度差异，用密度梯度离心将细胞膜从低速离心获得的粗核局
部中别离出来。
2．红细胞膜的制备
哺乳动物红细胞不含任何细胞器，故其红细胞膜是较纯净的细胞膜。
(1)红细胞血影膜
常用的制备方法是在低渗条件下，红细胞膨胀，由双面盘状变成近乎球形，随后细胞容
物因胞膜破裂而释放，20 000g 离心。洗涤去除血红蛋白，即获红细胞膜。此种膜最接近
整体系统，仍保存着原有膜的生物化学和生物物理学等特性，毒理学试验常用简易模型研
究外源化合物对细胞膜离子转运与相关酶类、膜脂流动性和细胞骨架结构等方面的影响，
并探讨其可能的机制。但它不能控制细胞质的环境，在应用上有一定的局限性。此外，低
渗制备的红细胞膜虽然去除了细胞质，但膜的封闭性差，有许多泄漏的空穴。
(2)再封血影
近年发现，在一定条件下，胀破了的红细胞可以重新封闭，对 K’等离子不通透，给研究
红细胞膜提供了另一模式。其制备的方法有：
① 向低渗胀破的红细胞参加浓盐溶液，成为等渗溶液，置于 37℃温育 20min，期间可缓
慢地搅拌，即得一定比例的再封血影。
② 将低渗胀破的红细胞在 0℃条件下，过 Bio—gel A 柱，柱上部的 1／3pH 为 7．6，以
利膜与血红蛋白别离，其下的 2／3pH 为 6．0，有利于随后红细胞空泡的重新封闭，当膜
从柱上流出后再用一定浓度的 Kcl 调节为等渗液，在 37℃温育 1h，即获得重新封闭的血
影。
(3)封闭的红细胞膜囊泡
有时为了深入研究，需要将膜的、外层翻过来。红细胞溶血后，在不含一价离子的碱性
低离子强度介质中，膜能自发地凹陷(无 Mg“存在)或外凸(有 Mg“存在)，形成小囊泡，通
过实验可制备封闭的红胞膜囊泡。其特点是不受胞浆容物的干扰，可采用匀浆，等密度梯
度离心或屏障别离等技术制备胞浆面在外的翻转泡(其、外层正好与血影膜相反)或胞浆面
仍在的正转泡(即与红细胞膜外侧一样的囊泡)。
3．脂质体的制备
脂质体是双层脂质包围一些水溶液的小滴，呈球形。它是最常用的人工膜之一，是较
为理想的生物膜模拟系统。大脂质体制备可将适量的磷脂溶于氯仿等有机溶剂，置于旋转
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