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第11章-体外试验与新生物技术在毒理学中的应用.doc
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第11章-体外试验与新生物技术在毒理学中的应用.doc
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第八章 毒理学评价的分子生物学方法
分子毒理学固然应主要着眼于生物大分子,但也应当看到这些大分子是存在于细胞膜
上、细胞器,乃至细胞间隙液中的。它们与细胞是不可别离的。因此,对亚细胞组分的研
究也是毒理学分子生物学评价的重要组成局部。
第一节 亚细胞组分的制备
现代毒理学中使用最多的亚细胞组分是细胞膜、微粒体与线粒体。现就细胞膜、微粒体
与线粒体的制备方法加以介绍。
一、细胞膜的制备
细胞膜指细胞外层质膜,厚度约 6~10nm。它将细胞与外环境分隔,且参与细胞的生
命活动,细胞各种细胞器也是由质膜分隔,称为细胞器膜,两者统称为生物膜。它是常用
的研究模型,用以从细胞和亚细胞水平研究外源化合物的中毒机制。
1.肝细胞膜的制备
其根本原理是:首先,将肝组织在含有钙离子的低渗碳酸氢钠缓冲液中温和匀浆,使
细胞膜保持较大的膜片;其次,应用低速离心使细胞膜片与细胞核一起从匀浆中别离,再
利用细胞膜与细胞核之间的密度差异,用密度梯度离心将细胞膜从低速离心获得的粗核局
部中别离出来。
2.红细胞膜的制备
哺乳动物红细胞不含任何细胞器,故其红细胞膜是较纯净的细胞膜。
(1)红细胞血影膜
常用的制备方法是在低渗条件下,红细胞膨胀,由双面盘状变成近乎球形,随后细胞容
物因胞膜破裂而释放,20 000g 离心。洗涤去除血红蛋白,即获红细胞膜。此种膜最接近
整体系统,仍保存着原有膜的生物化学和生物物理学等特性,毒理学试验常用简易模型研
究外源化合物对细胞膜离子转运与相关酶类、膜脂流动性和细胞骨架结构等方面的影响,
并探讨其可能的机制。但它不能控制细胞质的环境,在应用上有一定的局限性。此外,低
渗制备的红细胞膜虽然去除了细胞质,但膜的封闭性差,有许多泄漏的空穴。
(2)再封血影
近年发现,在一定条件下,胀破了的红细胞可以重新封闭,对 K’等离子不通透,给研究
红细胞膜提供了另一模式。其制备的方法有:
① 向低渗胀破的红细胞参加浓盐溶液,成为等渗溶液,置于 37℃温育 20min,期间可缓
慢地搅拌,即得一定比例的再封血影。
② 将低渗胀破的红细胞在 0℃条件下,过 Bio—gel A 柱,柱上部的 1/3pH 为 7.6,以
利膜与血红蛋白别离,其下的 2/3pH 为 6.0,有利于随后红细胞空泡的重新封闭,当膜
从柱上流出后再用一定浓度的 Kcl 调节为等渗液,在 37℃温育 1h,即获得重新封闭的血
影。
(3)封闭的红细胞膜囊泡
有时为了深入研究,需要将膜的、外层翻过来。红细胞溶血后,在不含一价离子的碱性
低离子强度介质中,膜能自发地凹陷(无 Mg“存在)或外凸(有 Mg“存在),形成小囊泡,通
过实验可制备封闭的红胞膜囊泡。其特点是不受胞浆容物的干扰,可采用匀浆,等密度梯
度离心或屏障别离等技术制备胞浆面在外的翻转泡(其、外层正好与血影膜相反)或胞浆面
仍在的正转泡(即与红细胞膜外侧一样的囊泡)。
3.脂质体的制备
脂质体是双层脂质包围一些水溶液的小滴,呈球形。它是最常用的人工膜之一,是较
为理想的生物膜模拟系统。大脂质体制备可将适量的磷脂溶于氯仿等有机溶剂,置于旋转
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蒸发仪上蒸发至干,使玻璃壁上附有一层极薄的磷脂膜,然后加水溶液,并振摇,即可形
成多层大脂质体。用超声波法和微量注射法、去垢剂法可获得单层脂质体。
4.突触体膜的制备
制备突触体膜的根本原理是将脑组织在预冷的蔗糖溶液中进展匀浆,再利用脑突触体
膜的蛋白质与脂的比例、电荷性质、颗粒大小、形状等不同于其他的细胞器膜进展蔗糖密
度梯度离心,将其别离出来。
二、微粒体的制备
微粒体是质网在细胞匀浆过程中形成的碎片,并非独立的细胞器。由于微粒体含有
代外源化合物的混合功能氧化酶,在毒理学研究中有着重要地位,是较常见的试验模型。
制备肝微粒体的方法有超速离心法、钙沉淀法、凝胶过滤法与等电点沉淀法。
根本步骤为:将肝组织匀浆后,2500g 离心;弃去沉淀(主要是细胞核与碎片),取
上清液 9000g 离心;弃去沉淀(主要是线粒体),取上清液,100 000g 离心,得到的沉淀
即为线粒体,上清液为胞浆。所得微粒体用缓冲液悬浮后,贮存在一 20~一 70℃冰箱中。
除超速离心法制备微粒体外,用凝胶过滤、钙沉淀法和等电点沉淀法也可以制得微
粒体。
三、线粒体的制备
1.肝脏线粒体的制备
所有操作应在低温条件下进展。全部器械如匀浆器、烧杯、离心管等,以与缓冲液
应放 4℃冰箱预冷。 2.亚线粒体颗粒的制备
亚线粒体颗粒是指经特殊处理,除去线粒体外膜和基质局部后形成的小囊泡。它含
有氧化磷酸化过程所有的酶类,是观察呼吸链氧化反响、ATP 酶活性与其他一些特殊反响
的模型。
亚线粒体颗粒制备的原理是利用超声波作用,破坏线粒体外膜,再经超速离心获得
仅有膜的亚线粒体颗粒。在超声处理过程中应注意保持线粒体制备物温度,不要升高,维
持在 4℃以下。
第二节 核酸的提取与制备
核酸的提取是分子生物学中很重要的根本实验技术,也是其他分子生物学分析方法的
前提条件。核酸样品的提取质量将直接关系到有关分析检测的成败。
别离纯化核酸总的原那么是应保证核酸一级结构的完整性与排除其他分子的污染。为
了保证孩酸结构与功能的研究,完整的一级结构是最根本的要求,因为遗传信息全部贮存
在一级结构之。核酸的一级结构还决定着其高级结构的形式以与和其他生物大分子结合的
方式。
经纯化的核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子,其
他生物大分子如蛋白质、多糖和脂类分子的污染应降低到最低程度,此外还要排除其他核
酸分子的污染,如提取 DNA 分子时,应去除 RNA 分子,反之亦然。
为了保证别离核酸的完整性和纯度,在实验过程中应注意:
① 尽量简化操作步骤,缩短提取过程,以减少各种有害因素对核酸的破坏。
② 减少化学因素对核酸的降解,为防止过酸、过碱对核酸链中磷酸二酯键的破坏,操
作多在 DH4~10 的条件下进展。
③ 减少物理因素对核酸的降解。物理降解因素主要是机械剪切力,其次是高温。机械
剪切力包括强力高速的溶液震荡、搅拌,使溶液快速地通过狭长的孔道,细胞突然置于低
渗液中,细胞爆炸式的破裂以与 DNA 样品的反复冻贮。机械剪切作用的主要危害对象是
对分子质量大的线性 DNA 分子,如真核细胞的染色体 DNA。对分子质量小的环状 DNA
分子,如质粒 DNA 与 RNA 分子,威胁相对小一些。高温,如长时间的煮沸,除水沸腾带
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来的剪切力外,高温本身对核酸分子中的有些化学键也有破坏作用。核酸提取过程中,常
规操作温度为 0~4℃,此温度环境可降低核酸酶的活性与反响速率,减少对核酸的生物
降解。
④ 防止核酸的生物降解。细胞或外来的各种核酸酶消化核酸链中的磷酸二酯键,直接
破环核酸的一级结构。其中 DNA 酶需要金属二价离子 Mg“,ca“的激活,使用金属二价离
子螯合剂乙二胺四乙酸(EDTA)、柠檬酸盐根本上可以抑制 DNA 酶的活性。而 RNA 酶不但
分布广泛、吸易污染样品,而且耐高温、耐酸、耐碱、不易失活,所以生物降解是 RNA 提
取过程中的主要危害习素。
总的来说,核酸提取的主要步骤就是破碎细胞,去除与核酸结合的蛋白质以与多糖
脂类等生物大分子,去除其他不需要的核酸分子,沉淀核酸,去除盐类、有机溶剂等杂质
纯化核酸等。
核酸提取的方案,应根据具体生物材料和待提取的核酸分子的特点而定。
一、DNA 的提取与制备
从细胞中提取 DNA 要用尽可能温和的细胞破碎法,以免 DNA 被机械破碎。操作时还
需要有 EDTA 的存在,以螯合镁离子,镁离子是 DNA 酶降解 DNA 所必需的。如果有细胞
壁,要用酶进展消除,如用溶菌酶处理细菌,对于细胞膜要用去污剂溶解。对于不同来源
的细胞、组织应使用不同的裂解液,如果必须使用物理破碎,一定要尽可能地轻缓。细胞
破碎以与其后的操作都要在 4cIC 条件下进展,所用的玻璃器皿和溶液都要经过高压灭菌
以破坏 DNA 酶。
上述方法只适用于细胞总 DNA 的提取。不同来源的样品,处理时有不同的考前须知。
对于新鲜动物组织脏器等提取材料,由于含有较丰富的 DNA 酶,应迅速冷冻保存备用,
以减少 DNA 的降解;石蜡包埋组织块中 DNA 应先进展脱蜡处理;培养细胞裂解之前应用
相应的缓冲液进展洗涤;质粒 DNA 提取之前先要经过细菌培养,获得对数生长后期的细
胞后进展离心集菌收集,再通过碱性裂解法、去污剂法或煮沸法等进展提取,纯化过程也
可使用酚/氯仿萃取法,对于小分子 DNA(小于 10kb),可用涡旋混合器以保证溶液中有
机相与水相混合均匀,当纯化 DNA 分子介于 10~30kb 时,应轻微振荡,防止 DNA 被机
械剪切,小于 30kh 的 DNA 分子纯化时应更小心。
二、RNA 提取与制备
RNA 提取技术与上述 DNA 提取技术相似。由于 RNA 分子相对较短,不易被剪切
力损伤,因此细胞破碎可以用较强有力的方法。RNA 对 RNA 酶敏感,而 RNA 酶在自然界
广泛存在,不仅各种细胞都有 RNA 酶,操作者的手指上也有 RNA 酶,因此操作者必须带
手套,并且提取液中要有较强的去污剂存在,以便快速灭活 RNA 酶。接下来的去蛋白操作
须特别强有力,因为 RNA 常常和蛋白质严密结合在一起。用 DNA 酶去除 DNA,用乙醇沉
淀 RNA。RNA 提取要用硫氰酸胍.它既是较强的 RNA 酶抑制剂,又是蛋白变性剂。制备
RNA 时所用物品应完全无 RNA 酶。
第三节 基因突变分析与 PCR 检测
一、基因突变分析
基因突变(gene mutation)包括碱基置换、移码突变和片段突变(参见第五章第二
节)。基因突变是分子水平的变化,在光学显微镜下无法看见,一般是以表型(如生长、生
化、形态等)的改乏为根底进展检测的,也可通过 DNA 测序、DNA 单链构象多态分析
(sscP)、基因差异分析与基因芯片检测等分子生物学方法检测 DNA 序列的改变来确定。
1.PCR—SSCP 技术
聚合酶链反响——单链构象多态性分析 在能够检测单个碱基变化的技术中,单链构
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