第41章-基因工程及蛋白质工程12PPT幻灯片.ppt

基因工程及蛋白质工程 基因工程是指对携带遗传信息的分子进行施工的分子工程，包括基因重组、克隆和表达。基因工程这个术语既可用来表示特定的基因施工项目，也可泛指它所涉及的技术体系，其核心是构建重组体DNA的技术，因此基因工程和重组体DNA技术(DNA recombination)有时也就成为同义词。 蛋白质工程是在基因工程基础上发展起来的。是指通过对蛋白质已知结构与功能的认识，借助计算机辅助设计，利用基因定位诱变等技术改造蛋白质，以达到改进其某些性能的目的。 基因工程的历史可以追溯到1972年，美国斯坦福大学的Berg和他的同事将λ噬菌体基因和大肠杆菌乳糖操纵子插入猴病毒SV40 DNA中，首次构建出DNA的重组体。1973年，Cohen和Boyer获得了抗四环素和新霉素的重组菌落，标志着基因工程的诞生。 技术上的三大发现： 1. 限制性内切酶和DNA连接酶的发现（标志着DNA重组时代的开始）。 2. 载体的使用。 3. 逆转录酶的发现。 限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）又称限制性内切酶，简称为限制酶。这类酶能识别双链DNA分子内部的特异位点并且裂解磷酸二酯链。主要存在于原核细菌中，帮助细菌限制外来DNA的入侵。 1968年，Smith等人首先从流感嗜血杆菌d株中分离出Hind II和Hind III。 限制性核酸内切酶的命名和分类： 1. 限制性核酸内切酶的命名属名种名株名Haemophilus influenzae d（嗜血流感杆菌d株）Hind IIHind III同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶 2. 限制性核酸内切酶的分类 I 型II 型III 型 蛋白结构限制修饰辅助因子识别序列切割位点双功能异源三聚体ATP Mg2+ SAM TGAN8TGCT（Eco B） AACN6GTGC（Eco C） 距识别序列1 kb处随机性切割单功能同源二聚体Mg2+旋转对称序列 识别序列内或附近特异性切割双功能异源二聚体ATP Mg2+ SAM GAGCCCAGCAG距识别序列下游24-26 bp处 II型限制酶的识别和切割位点： II 型限制性核酸内切酶的基本特性： * 识别双链DNA分子中4-8对碱基的特定序列 * 大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧 * 识别切割序列呈典型的旋转对称型回文结构（palindrome） EcoR I的切割位点： EcoR I的识别序列 5‘ … G C T G A A T T C G A G … 3’ 3‘ … C G A C T T A A G C T C … 5’ 5‘ … G C T G A A T T C G A G … 3’ 3‘ … C G A C T T A A G C T C … 5’ EcoRI等产生的5‘粘性末端（Sticky end） 退火4-7 ℃ 3‘ … C-G-A-G A-C-G-T-C-C-T-C … 5’ P OH 5‘ … G-C-T-C-T-G-C-A G-G-A-G … 3’ 3‘ … C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C … 5’ PstI 等产生的3‘粘性末端 5‘ … G-C-T-C-T-G-C-A G-G-A-G … 3’ 3‘ … C-G-A-G A-C-G-T-C-C-T-C … 5’ PstI 37 ℃ 3‘ … C-G-A-G-P OH-A-C-G-T-C-C-T-C … 5’ 5‘ … G-C-T-C-T-G-C-A-OH P-G-G-A-G … 3’ 退火 4-7 ℃ 5‘ … G-C-T-C-T-G-C-A G-G-A-G … 3’ 3‘ … C-G-A-G A-C-G-T-C-C-T-C … 5’ P OHHO P PvuII等产生的平头