基因工程是一种生物技术，它涉及将外源基因（目的基因）插入宿主细胞的基因组中，以实现特定的遗传修饰。在这个过程中，有多个关键步骤和工具涉及到，包括：
1. **限制性核酸内切酶**：这些酶能够识别并切割DNA分子上特定的核苷酸序列，形成粘性末端。例如，题目中提到的EcoRⅠ和KpnⅠ都是这类酶。EcoRⅠ识别GAATTC序列并在G和A之间切割，而KpnⅠ则识别其他序列并切割。这种切割作用是酶的专一性体现。
2. **DNA连接酶**：酶的另一个重要作用是将切割后的DNA片段连接起来。如题目中指出，DNA连接酶催化两个具有相同粘性末端的DNA片段间的磷酸二酯键形成，使DNA分子重新连接。这种连接过程对于重组DNA分子的构建至关重要。
3. **质粒**：基因工程中常用的载体，通常是从细菌细胞中提取的环状DNA分子。质粒可以在宿主细胞中自我复制，并能携带外来基因。在构建重组质粒时，目的基因会被插入到质粒中的特定位置，通常是取代某个抗性基因（如题目中提到的抗链霉素基因A或抗氨苄青霉素基因B）。
4. **重组质粒的构建**：这个过程需要限制性核酸内切酶和DNA连接酶。目的基因和质粒被同一种限制酶切割，产生相同的粘性末端，然后通过DNA连接酶连接，形成重组质粒。重组质粒需导入宿主细胞（如大肠杆菌），并需要选择性标记（如抗性基因）来筛选成功的转化细胞。
5. **筛选与表达**：导入重组质粒的大肠杆菌在特定抗生素培养基上生长，如抗氨苄青霉素培养基，只有成功导入重组质粒的细胞才能存活。而抗病毒转基因植物的成功表达意味着植物产生了抵抗某种病毒的蛋白，但通常这种抗性是特异性的，不能抵抗所有病毒。
6. **植物转化**：在抗虫棉的例子中，经过遗传改造的细胞可以发育成愈伤组织，进一步分化成再生植株。再生植株的基因型通常与愈伤组织相同，但有性生殖的后代可能因重组而不稳定地保持抗虫性状。
7. **标记基因**：如卡那霉素抗性基因，用于筛选成功转化的细胞。如果标记基因（如卡那霉素抗性基因）被破坏或包含限制酶的识别位点，那么它将无法发挥筛选作用，因此在构建重组质粒时，标记基因的完整性很重要。
总结来说，基因工程是一个复杂的过程，涉及DNA的精确切割、连接、载体的选择和改造，以及目标基因在宿主细胞中的表达。这个过程需要一系列生物技术和分子生物学工具，如限制酶、连接酶、质粒以及选择性标记，确保目的基因的有效插入和表达。在实际操作中，每一步都需要精细控制和验证，以确保基因工程的准确性和效率。
