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PCR引物设计PPT学习教案.pptx
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会计学
1
PCR
引物设计
十条
PCR
引物的设计原则总
述
①
引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。
②
产物不能形成二级结构。(
如何避免)
③
引物长度一般在
15~30
碱基之间。(
太长和太短?)
④
G+C
含量在
40%~60%
之间。
⑤
碱基要随机分布。
⑥
引物
自身
不能有连续
4
个碱基的互补
。(引物二聚合
体)
⑦
引物
之间
不能有连续
4
个碱基的互补。
⑧
引物
5’
端可以
修饰
。
⑨
引物
3’
端不可修饰。
⑩
引物
3’
端要避开密码子的第
3
位
。
第
1
页
/
共
27
页
1.
引物的特异性
引物与非特异扩增序列的同源性不要超过
70%
或有连续
8
个互补碱基同源。
有时由于模板的复杂性而无法判断,但尽量避免和
基因内部有过高的同源性
哪些
D
NA
片段可作为模板?
GFP
在质粒上,和
GFP
在基因组上?哪个作为模板,更容易得到专
一的
GFP
片段?
第
2
页
/
共
27
页
2.
避开产物的二级结构
区
某些引物无效的主要
原因是引
物重复区
DNA
二级结构
的影响,
选择扩增片段时最好
避开
二级结
构区域
。用有关计算
机软件可以
预测估计
mRNA
的稳
定二级结
构
,有助于选择模板。
实验表明,
待扩区域自由能(△
G
°
)
小于
58.6lkJ/m
ol
时,扩增
往往不
能成功
。
第
3
页
/
共
27
页
3.
长度
寡核苷酸引物长度为
15~30
bp
,一
般为
20~27
mer
。引物的有效长度:
Ln=2
(
G+C
)
+
(
A+T
),
Ln
值不能大于
38
,因
为
>38
时,最适延伸温度会
超过
T
aq
DNA
聚合酶的最适
温度
(
74℃),
不能保证产
物的特异
性。
第
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