RTPCR实验方式简介.ppt

RT-PCR，全称为逆转录聚合酶链式反应（Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction），是一种在分子生物学领域广泛应用的技术，用于检测和定量特定的RNA分子。该技术结合了逆转录和PCR两个步骤，使得研究人员能够分析和研究特定基因的转录水平。 在RT-PCR实验中，首先需要提取样本中的总RNA。为了确保RNA的完整性，实验过程中必须严格防止RNA酶的污染，这可以通过高温处理、DEPC水处理、去污剂洗涤以及使用RNA专用的试剂来实现。同时，新鲜或恰当保存的材料是高质量RNA的前提，避免反复冻融可以减少RNA的降解。通过测定RNA溶液的吸光度和电泳图谱，可以评估RNA的质量，理想的28S和18S rRNA条带应明亮清晰，28S的亮度是18S的两倍以上。 接下来是反转录步骤，将提取的RNA反转录成cDNA。有两种常见的方法：一步法和两步法。一步法将反转录和PCR合并在一个反应管中，提高灵敏度但可能引入干扰；而两步法则将两个步骤分开，虽然灵敏度略低，但更便于控制和排除干扰。 PCR阶段，通常会设置参照基因（如18S、β-actin、bubulin、GAPDH等）作为内参或外参，以校正实验误差并确定模板量的准确性。目的基因的PCR需要设计特异性引物，长度通常为18到24个核苷酸，以确保其只针对目标序列，减少非特异性扩增。 在实际操作中，例如分析拟南芥突变体m1和m2中G1基因表达差异的实验，需要设计ACTIN和G1基因的引物，对不同样本进行RNA提取、DNase I处理、反转录、PCR扩增，并通过电泳检测和调整模板量，以确保各样本间的一致性。根据G1基因电泳条带的亮度对比，可以评估突变体与野生型之间的表达差异。 RT-PCR技术在生物医学研究、遗传学、病毒学等领域有着广泛的应用，它可以精确地检测基因表达的细微变化，为科学研究和临床诊断提供了强有力工具。然而，实验过程中的每一步都需要严格控制，以确保结果的可靠性和准确性。