PKC-MARCKS信号转导系统在急性多发脑梗死大鼠海马中的作用资源-CSDN文库

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PKC-MARCKS 信号转导系统在急性多发脑梗死大

鼠海马中的作用

张允岭

，张綦慧

，白文

，张锦

，

韩振蕴

，娄金丽

，郑宏

，闫妍

1. 北京中医药大学东方医院，北京（100078）

2. 北京大学人民医院，北京（100044）

E-mail:yunlingzhang2004@yahoo.com.cn

摘要：目的，研究急性多发脑梗死大鼠海马 MARCKS 磷酸化动态变化与急性缺血损害的

关系。方法采用改良 Kaneko 法建立急性多发脑梗死动物模型，观察模型 1h、6h、24h、

72h、7d 组大鼠海马病理组织学改变，应用免疫组织化学和 Western blotting 方法检测缺血各

时间点大鼠海马 MARCKS 磷酸化表达变化。结果，海马组织病理学以缺血 24h 后病理改变

为著。急性缺血海马 MARCKS、p-MARCKS 均为过高表达，24h 表达最高，过表达最显著，

24h 后表达降低，7d 表达略回升，形成动态变化。结论，急性多发脑梗死大鼠海马 24h 后缺

血损害明显，24h 海马 MARCKS 磷酸化过表达最显著，在急性脑缺血状态下大鼠海马

MARCKS 磷酸化过高表达，与缺血损害关系密切。

关键词：急性多发脑梗死；大鼠海马；MARCKS；磷酸化

中图分类号：

细胞内存在着多种信号转导方式和途径，明确细胞信号转导的过程对于认识细胞在整个

生命过程中的增殖、分化、代谢及死亡等诸方面的表现和调控方式，进而在分子水平认识各

种疾病的发病机制具有重大的意义

[1]

。底物蛋白磷酸化是各信使系统作用的最后通路，同时

又是各信使系统间进行调控的枢纽

[2]

。蛋白激酶 C（Protein kinase C, PKC）作为一种重要的

蛋白激酶和细胞内信号分子，与神经细胞的多种活动有关，如轴突的生长、树突棘的形成、

基因表达、长时程增强以及神经递质的释放等

[3,4]

。MARCKS（myristoylated alanine-rich C

kinase substrate）是 PKC 特异性底物蛋白，在 PKC 的作用下，发生磷酸化反应，参与跨膜

信息传递与脑组织的发育，参与细胞的转移、粘附、分泌，以及细胞的内摄、外放和吞噬作

用

[5]-[7]

。

既往研究发现，在急性多发脑梗死状态下大鼠海马 MARCKS 和 p-MARCKS 表达异常

升高，与缺血损害关系密切

[8]

。在脑缺血损害导致细胞变性死亡、功能丧失过程中，是否存

在着 MARCKS 磷酸化表达的动态变化，这种变化是否与神经细胞变性坏死相关，至今尚未

有明确报道。本研究通过对于急性缺血不同时间点大鼠海马 MARCKS 磷酸化表达动态变化

与海马缺血损害的关系的研究，以探讨急性缺血海马 MARCKS 磷酸化表达的动态变化与急

性缺血损害的关系。

1．材料与方法

1.1 实验动物及分组

健康雄性 Wistar 大鼠 119 只，体重 340±25 克，购自北京维通利华实验动物技术有限公

本课题得到 2004 年度高等学校博士学科点专项科研基金资助课题、2005 年教育部科学技术重点项目的资

助。

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司，许可证编号：SCWK（京）2002-2003。按数字表法随机分为 7 组，正常组、假手术组、

模型 1h、6h、24h、72h、7d 组，每组 17 只大鼠。

1.2 模型制备

采用同种系体外微栓子注入法（改良 Kaneko 法

[10]

），于大鼠右侧颈外动脉注入同种系大

鼠血栓栓子溶液 0.3ml。假手术组手术方法相同，但注射为等量的生理盐水。根据 Bederson

评分标准对造模后大鼠进行神经系统症状观察

[11]

，并记录评分，分 0 分、1 分、2 分、3 分、

4 分、5 分共 6 个分值。

1.3 材料与仪器

羊抗 MARCKS 多克隆抗体、羊抗 p-MARCKS 多克隆抗体、Donkey a Cro IgG/HRP、ECL

购自 Santa Cruz Biotechnology；Leupeptin、Pepstatin A、NP-40、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰

胺、APS、SDS、甘氨酸、Tween-20、Tris 碱、TEMED、溴酚蓝、甘油、硼酸均为 Sigma

产品；DTT 为 Mcrck 产品；PMSF 为 Serva 产品；NC 膜购自 Millipore 公司；3MM 滤纸为

Walkerman 产品；脱脂奶粉为 Fluka 产品；甲醇为 Riedel-de 产品；蛋白定量试剂盒、预染蛋

白 Marker（116、94、47、37、27.5、19.3 kDa）购自北京赛百盛基因技术有限公司；免疫

组织化学试剂盒、PBS 由北京中杉金桥生物技术有限公司提供；异丙醇、浓盐酸、无水酒精

为分析纯，购自北京化工厂。

紫外分光光度计为 Amersham Biosciences 3300 pro UV/VIS 型、垂直电泳仪为 Amersham

Biosciences mini VE 型、半干转移槽为 Amersham Biosciences Hoefer TE 70 型、成像、扫描

及图像分析系统为 Syngene 成像及分析软件。

1.4 取材方法

1.4.1 光镜标本

大鼠于 10℅水合氯醛麻醉后，剪开胸腔，暴露心脏，9

针头穿刺左心室并剪开右心耳，

用 37℃、0.9℅生理盐水 200ml+12500u 肝素钠灌洗，至右心耳流出液无色透明，再用 4℅多

聚甲醛灌洗固定，待大鼠僵硬后，再迅速断头取脑，继续置于 4℅多聚甲醛溶液中固定至少

24h 以上。从额极至枕叶每间隔 2mm 连续冠状切片，常规梯度酒精脱水，石蜡包埋，连续

切片（4μm），HE 染色及 MARCKS、p-MARCKS 免疫组织化学检测。

1.4.2 电镜标本

大鼠于 10℅水合氯醛麻醉后，剪开胸腔，暴露心脏，9

针头穿刺左心室并剪开右心耳，

用 37℃、0.9℅生理盐水 200ml+12500u 肝素钠灌洗，至右心耳流出液无色透明，再用 4℃、

3℅戊二醛溶液灌洗固定，迅速断头取脑，于患侧海马、额叶皮层部位取 1cm

组织块，继续

置于 3℅戊二醛中后固定 2h，分别用 1℅四氧化锇作用 2h，梯度酒精脱水，环氧丙烷置换，

Epon812 环氧树脂包埋，LKB-V 型超薄切片机切片，厚度 50～60nm，电子染色，用透射电

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