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书书书
第
36
卷
第
10
期
中
国
激
光
Vol.36
,
No.10
2009
年
10
月
犆犎犐犖犈犛犈犑犗犝犚犖犃犔犗犉犔犃犛犈犚犛
犗犮狋狅犫犲狉
,
2009
文章编号:
02587025
(
2009
)
10247708
相干反斯托克斯拉曼散射显微成像技术
尹
君
1
,
2
林子扬
2
屈军乐
2
于凌尧
2
刘
星
2
万
辉
2
牛憨笨
2
1
华中科技大学光电子科学与工程学院,湖北 武汉
430074
2
深圳大学光电子学研究所,光电子器件与系统(教育部/广东省)重点实验室,广东 深圳
( )
518060
摘要
回顾了相干反斯托克斯拉曼散射(
CARS
)显微成 像技 术的理 论和 技术的 发展,介绍 和 比较 了
CARS
显 微成
像技术对抽运光源的要求,以及典型的
CARS
显微成像系统。对
CARS
显微成像技术中无法避免的最重要 的非 共
振背景噪声问题做了详细的分析,对不同的抑制非共振背 景噪 声的 方 法进 行了 比 较和 讨论,对
CARS
显 微成 像技
术目前存在的问题和可能解决途径进行了简要的分析
。
关键词
激光光学;显微成像方法;相干反斯托克斯拉曼散射;非共振背景噪声;超连续谱;光子晶体光纤
中图分类号
O437.3
;
Q631
文献标识码
A
犱狅犻
:
10.3788
/
犆犑犔20093610.2477
犆狅犺犲狉犲狀狋犃狀狋犻犛狋狅犽犲狊犚犪犿犪狀犛犮犪狋狋犲狉犻狀
犵
犕犻犮狉狅狊犮狅
狆
犻犮犐犿犪
犵
犻狀
犵
犜犲犮犺狀犻
狇
狌犲
犢犻狀犑狌狀
1
,
2
犔犻狀犣犻
狔
犪狀
犵
2
犙狌犑狌狀犾犲
2
犢狌犔犻狀
狔
犪狅
2
犔犻狌犡犻狀
犵
2
犠犪狀犎狌犻
2
犖犻狌犎犪狀犫犲狀
2
1
犆狅犾犾犲
犵
犲狅
犳
犗
狆
狋狅犲犾犲犮狋狉狅狀犻犮犛犮犻犲狀犮犲犪狀犱犈狀
犵
犻狀犲犲狉犻狀
犵
,
犎狌犪狕犺狅狀
犵
犝狀犻狏犲狉狊犻狋
狔
狅
犳
犛犮犻犲狀犮犲犪狀犱犜犲犮犺狀狅犾狅
犵狔
,
犠狌犺犪狀
,
犎狌犫犲犻
430074
,
犆犺犻狀犪
2
犓犲
狔
犔犪犫狅狉犪狋狅狉
狔
狅
犳
犗
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狋狅犲犾犲犮狋狉狅狀犻犮犇犲狏犻犮犲狊犪狀犱犛
狔
狊狋犲犿狊狅
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犕犻狀犻狊狋狉
狔
狅
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犈犱狌犮犪狋犻狅狀犪狀犱犌狌犪狀
犵
犱狅狀
犵
犘狉狅狏犻狀犮犲
,
犐狀狊狋犻狋狌狋犲狅
犳
犗
狆
狋狅犲犾犲犮狋狉狅狀犻犮狊
,
犛犺犲狀狕犺犲狀犝狀犻狏犲狉狊犻狋
狔
,
犛犺犲狀狕犺犲狀
,
犌狌犪狀
犵
犱狅狀
犵
518060
,
烄
烆
烌
烎
犆犺犻狀犪
犃犫狊狋狉犪犮狋
犐狀狋犺犻狊
狆
犪
狆
犲狉
,
狋犺犲狅狉犲狋犻犮犪犾犪狀犱狋犲犮犺狀犻犮犪犾犱犲狏犲犾狅
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犵
(
犆犃犚犛
)
犿犻犮狉狅狊犮狅
狆狔
犻狊狉犲狏犻犲狑犲犱.犜犺犲狉犲
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狆狔
狅狀狋犺犲
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狌犿
狆
犾犪狊犲狉狊狅狌狉犮犲犪狀犱狋
狔狆
犻犮犪犾犲狓
狆
犲狉犻犿犲狀狋犪犾
犻狀狊狋狉狌犿犲狀狋犪狋犻狅狀犪狉犲犱犻狊犮狌狊狊犲犱犪狀犱犮狅犿
狆
犪狉犲犱.犠犲犻狀狏犲狊狋犻
犵
犪狋犲狋犺犲狀狅狀狉犲狊狅狀犪狀犮犲犫犪犮犽
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狉狅狌狀犱狀狅犻狊犲狑犺犻犮犺犻狊狋犺犲犿狅狊狋
犮狉犻狋犻犮犪犾
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狉狅犫犾犲犿犪狀犱犮犪狀狀狅狋犫犲犪狏狅犻犱犲犱犻狀狋犺犲犆犃犚犛 犿犻犮狉狅狊犮狅
狆狔
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狉犲狊狊犻狀
犵
狀狅狀狉犲狊狅狀犪狀狋
犫犪犮犽
犵
狉狅狌狀犱狀狅犻狊犲犪狉犲
狆
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狔
,
犪犫狉犻犲犳犪狀犪犾
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狉狅犫犾犲犿狊犻狀犆犃犚犛犿犻犮狉狅狊犮狅
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狅狊狊犻犫犾犲狊狅犾狌狋犻狅狀狊犻狊
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狉犲狊犲狀狋犲犱.
犓犲
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狑狅狉犱狊
犾犪狊犲狉狅
狆
狋犻犮狊
;
犿犻犮狉狅狊犮狅
狆
犻犮犻犿犪
犵
犻狀
犵
犿犲狋犺狅犱
;
犮狅犺犲狉犲狀狋犪狀狋犻犛狋狅犽犲狊 犚犪犿犪狀狊犮犪狋狋犲狉犻狀
犵
;
狀狅狀狉犲狊狅狀犪狀犮犲
犫犪犮犽
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;
狊狌
狆
犲狉犮狅狀狋犻狀狌狌犿
;
狆
犺狅狋狅狀犻犮犮狉
狔
狊狋犪犾犳犻犫犲狉
收稿日期:
20090708
;收到修改稿日期:
20090810
基金项目:国家自然科学基金(
60627003
)、广东省高等学校科技创新团队项目(
06CXTD009
)和教育部高等学校博士学科
点专项基金(
2007059000
)资助课题。
作者简介:尹
君(
1975
—),男,博士研究生,主要从事
CARS
光谱和显微成像技术等方面的研究。
Email
:
y
in
j
un666
@
163.com
导师简介:牛憨笨(
1940
—),男,研究员,主要从事光学工程、生物医 学光 子学、超快 诊 断、光 电子 材 料与 器件 等 方面 的研
究。
Email
:
hbniu
@
szu.edu.cn
(通信联系人)
1
引
言
光学方法在 生命科学研 究中占有重 要的地位,
20
世纪
60
年代激光器的发明为光学方 法提供了理
想的高强度光源,大 大 拓展了光 学 这一古老 学 科在
生命科学等众多研究领域中的应用。随着超短脉冲
激光、荧光探针标记、微弱信号探测和显微成像技术
的不断发展
,光学显 微 成像技术 已 经成为推 动 生命
科学研究发展的重要动力。具有高时间和空间分辨
率、高探测灵敏度和化学选择性,又能够实时获取待
测样品三维层析图像的显微成像技术成为发展的重
点,特别是通过共焦 探 测方式实 现 三维层析 能 力的
荧光共焦显微镜
[
1
]
和多光子 激 发荧光显 微 镜
[
2
,
3
]
已
中
国
激
光
36
卷
经成为 生 物 学、医 学 和 生 命 科 学 强 有 力 的 研 究 工
具
[
4
~
9
]
。利用荧光探针虽然能够提供荧光显微成像
技术所需的化学选择性
[
10
,
11
]
,但是 外加的 荧 光标记
对生物细胞自身性 质的影响,以及荧光 团 自身的光
致漂白损伤
[
12
]
是无法回避的问题。近年来,基于物
质分子固有的分子振动光谱信号的非侵入显微成像
技术引起人们的广泛关注
,其中红 外成像
[
13
]
及自发
拉曼成像
[
14
]
是 最 早 提 出 的 两 种 显 微 成 像 技 术。 但
是这两种技术存在空间分辨率低、探测灵敏度差、所
需激发光功率高和 数据采集 时 间长等问 题,限 制 了
其在活体组织和活细胞研究中的应用。
通 过 表 面 增 强 拉 曼 散 射 (
surface enhanced
Ramanscatterin
g
,
SERS
)技术可以显著改善自发拉
曼散射 成 像 技 术 的 信 噪 比,提 供 单 分 子 探 测 灵 敏
度
[
15
]
,但是在待测样品中额外加入的胶质金 属粒子
也会对生物分子的性质产生影响。相干反斯托克斯
拉曼散 射 (
coherentantiStokesRamanscatterin
g
,
CARS
)是一种三阶非线性光学 过程,通 过共振激发
大大提高了单分子探测的灵敏度。
1965
年,
P.D.
Maker
等
[
16
]
首次发现了这一过程,并 进行了系统 的
研究。
1974
年,
R.F.Be
g
le
y
等
[
17
]
首 次 提 出 了
CARS
光谱研究技术的设想,
CARS
光谱仪诞生,并
作为进行化学分析的光谱学分析工具得到了广泛的
应用。
1982
年,美 国海军实 验 室的
M.D.Duncan
等
[
18
]
通过将两 台 染 料 激 光 器 输 出 的 连 续 激 光 聚 焦
在待测样品中激发产 生
CARS
光谱信号,首次 成功
地实现了
CARS
显 微 成 像 技 术。
CARS
显 微 成 像
技术将
CARS
与 传 统 的 光 学 显 微 成 像 技 术 结 合 在
一起
,利用待测样品 中 特定分子 所 固有的分 子 振动
光谱信号作为显微 成像的对 比 度,能 够在无需 引 入
外源标记的条件下选择性地快速获取样品中特定分
子的空间分 布 图 像 以 及 分 子 之 间 相 互 作 用 的 功 能
信息。
近年来,为 了 优 化
CARS
显 微 成 像 系 统,提 高
探测灵敏度,改善时间和空间分辨率,世界各国的科
研工作者进行了大 量 卓有成效 的 研究和改 进 工作,
探索使用这一方法快速获取活体组织和细胞的结构
和功能图像。本文通过 对
CARS
过程原理的 介绍,
分析了实现
CARS
显微成像 技术的要求,对 具有不
同特 点 的
CARS
显 微 成 像 技 术 进 行 了 比 较。 对
CARS
显微成像技 术中至关 重 要 的 问 题,非 共 振 背
景噪声抑制的解决方案进行了详细的讨论。通过对
近年来利用
CARS
显 微 镜 在 生 物 学 研 究 中 所 取 得
的研究成果的总结,说明这一技术在生物学、医学和
生命科学等众多研 究领域具 有 广泛的应 用 前景
;分
析了
CARS
显微成像技术目 前存在的问 题,并提出
了解决这些问题的可能途径。
图
1 CARS
过程原理的能级示意图
Fi
g
.1 Ener
gy
levelschematicofCARS
p
rocess
2
理论基础
CARS
过程 是 一 个 四 波 混 频 的 非 线 性 光 学 过
程,在这一过程中包 含 特定的拉 曼 活性分子 的 振动
模式与导致分子系统中基态至激发态振动跃迁的入
射光场相互作用的过程。
CARS
过程原理的能级示
意图如图
1
所示,图
1
(
a
)表示拉曼共 振和非共振 单
光子增强对
CARS
过程的贡献,图
1
(
b
)表示拉曼共
振和非共 振 双 光 子 增 强 对
CARS
过 程 的 贡 献。 图
中,
υ
表示具有
Ω
r
振动频率的拉曼模式的振动状态,
g
和
e
分 别 表 示 基 态 和 激 发 态。 中 心 频 率 分 别 为
ω
P
,
ω
′P
和
ω
S
的 抽 运 (
犈
P
)、探 测 (
犈
′P
)和 斯 托 克 斯
(
犈
S
)
3
束激光光束 入 射 到 待 测 样 品 中,与 样 品 中 特
定的具有拉曼活性的 分 子相互作 用,入 射 光场与样
品相互作用在焦点处激发产生的三阶非线性极化强
度
犘
(
3
)
可以表示为
[
19
]
犘
(
3
)
=
犘
(
3
)
NR
+
∑
狉
犘
(
3
)
R
=
χ
(
3
)
NR
+
∑
狉
χ
(
3
)
( )
R
犈
P
犈
′P
犈
犛
, (
1
)
式中
χ
(
3
)
表示三阶非线性极化系数共振部分,
χ
(
3
)
R
表
示 样 品 中 的 分 子 的 拉 曼 响 应, 是 复 数 量
(
χ
(
3
)
R
=
χ
(
3
)
′R
+
χ
(
3
)
″R
)。当
犈
P
和
犈
S
之间的频差与具有
拉曼活性的分子的振动频率匹配时(
Ω
r
=
ω
P
-
ω
S
),
激发 产 生 的
犘
(
3
)
R
得 到 共 振 增 强,如 图
1
(
a
)所 示,
CARS
信号的强度正比于
犘
(
3
)
R
。非共振部分
χ
(
3
)
NR
表
示单光子[见图
1
(
a
)]和双光子[见图
1
(
b
)]电子跃迁
的电子响应,本质上与入射激光的频率无关,是实数
量。由(
1
)式可以看出,当激发光与样品相互作用时,
总的信号由样品的
χ
(
3
)
产生,是共振和非共振两部分
叠加的结果。由于
CARS
过程是一个参量过程,因此
需要满足相位匹配 条件
:
狘
Δ
犽
狘
·
犾
π
,其 中
Δ
犽
=
犽
AS
-
(
犽
P
+
犽
′P
-
犽
S
)是波矢失配量,
犾
是相 互作用长
8742
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