小菜蛾对杀虫双抗性遗传的RDA分析 (2003年)

采用代表性差异分析法(RDA Representational difference analysis)初步研究了小菜蛾两个品系，敏感品系和抗杀虫双近等基因系之间基因组的差异.用敏感品系作为驱动扩增子(ariver)，抗杀虫双近等基因系作为检验扩增子(tester)，通过四轮消减杂交后，得到两个差异片段，范围在150bp至300bp之间，初步判断这些片段可能与小菜蛾杀虫双抗性的遗传分子基础相关. ### 小菜蛾对杀虫双抗性遗传的RDA分析 #### 1. 引言 小菜蛾（*Plutella xylostella*）是全球范围内十字花科作物的重要害虫之一，广泛分布在中国各地。由于其高度的适应性和繁殖能力，小菜蛾已经对包括有机磷类、氨基甲酸酯类、拟除虫菊酯类等多种类型的杀虫剂产生了高水平抗性。目前，关于小菜蛾抗药性的研究大多集中在田间抗性检测、生理生化机制以及普通遗传学层面，而对于抗药性发生的遗传本质及其相关基因的表达与调控等分子水平的研究相对较少。 杀虫双作为一种沙蚕毒素类杀虫剂，通过作为乙酰胆碱的竞争性抑制剂来干扰昆虫的神经传导系统，导致昆虫死亡。之前的研究显示，小菜蛾对杀虫双的抗性可能与特定的酯酶同工酶的形成及部分非特异性酯酶同工酶活性的变化有关[1]。此外，也有研究表明多功能环氧化物酶活性的提升与小菜蛾对杀虫双的抗性有关[2]。已有证据表明，小菜蛾对杀虫双的抗性遗传方式涉及多个基因，并且主效基因呈不完全显性遗传模式[3]。因此，小菜蛾对杀虫双的抗性具有多种机制，其抗性遗传的分子基础尚未完全阐明。 为了深入探究小菜蛾对抗性产生及遗传机制的理解，本研究采用了代表性差异分析法（Representational Difference Analysis, RDA）这一技术手段，旨在从DNA分子水平上探索小菜蛾对杀虫双抗性遗传的基础。 #### 2. 材料与方法 ##### 2.1 材料 实验所用的小菜蛾敏感品系和抗性近等基因系由贵州省农业科学院植物保护研究所提供。 ##### 2.2 RDA引物设计 RDA引物的设计参考了Lisi等人的文献[7]。具体的引物序列如下： - R-Bam24：5’-AGCACTCTCCAGCCTTCACCGAG-3’; - R-Bam12：5’-GATCCTCGGGGAT-3’; - J-Bam24：5’-ACCGACGTCGACTATCCGAACG-3’; - J-Bam12：5’-GATCCGTCATG-3’; - N-Bam24：5’-AGGCAACTGTGCTATCCGAGGGAG-3’; - N-Bam12：5’-GATCCTCCCTCG-3’. 上述引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。 ##### 2.3 DNA提取 将各品系的小菜蛾成虫冷冻保存于-80°C环境中，然后转移至1.5 mL Eppendorf管中。加入200 μL TE缓冲液进行匀浆处理，随后加入55 μL 10% SDS，并在65°C水浴中保温1小时。之后加入1 μL蛋白酶K，并在37°C条件下保温20分钟。接着，再次加入55 μL 3 M NaAc，并继续在37°C水浴中保温1小时。 #### 3. RDA技术概述 代表性差异分析法（RDA）是一种用于研究两种相似基因组之间的差异的理想方法，它结合了PCR技术、消减杂交和动态富集技术。该方法通过选择两种来源相近的组织或细胞的基因组DNA，利用合适的限制性内切酶进行消化，从而获得一系列限制性内切酶片段（ARF）。随后，通过连续几轮消减杂交，可以使特定的DNA片段富集达到10^5到10^6倍，这样即使是普通的琼脂糖凝胶电泳也可以检测到这些特异性的片段。RDA技术因其操作简便、速度快、重复性好、灵敏度高等优点而被广泛应用于癌症基因和抑癌基因的克隆[4]、致病病原体的分离鉴定[5]以及与特定性状相关的多态性标记物的分离[6]等领域。 #### 4. 实验结果 通过对敏感品系和抗性近等基因系的基因组DNA进行RDA分析，研究人员发现了两个差异片段，大小在150 bp至300 bp之间。初步判断这些差异片段可能与小菜蛾对杀虫双抗性的遗传分子基础相关联。 #### 5. 结论 通过采用RDA技术，本研究初步揭示了小菜蛾敏感品系和抗性近等基因系之间存在的基因组差异，并发现了可能与抗性相关的基因片段。这些发现为进一步探索小菜蛾对杀虫双抗性的遗传分子机制提供了重要的线索，也为开发新的抗性管理策略奠定了基础。未来的研究可以通过进一步的功能验证来确认这些差异片段的确切作用及其与抗性机制的关系。 --- *注释*： 1. 陈之浩等。小菜蛾对杀虫双的抗性与特定酯酶同工酶的形成及部分非特异性酯酶同工酶活性变化的关系。未引用的具体文献。 2. 程罗根等。多功能环氧化物酶活性提高与小菜蛾对杀虫双抗性相关性研究。未引用的具体文献。 3. 李凤良等。小菜蛾对杀虫双抗性遗传方式的研究。未引用的具体文献。 4. 关于癌症基因和抑癌基因克隆的文献未具体引用。 5. 关于致病病原体的分离鉴定文献未具体引用。 6. 关于与特定性状相关的多态性标记物分离的文献未具体引用。 7. Lisi等人关于RDA引物设计的文献未具体引用。