OX40L在小鼠B16黑素瘤细胞中表达及对活化淋巴细胞凋亡影响 (2009年)

目的:构建 OX40L的真核表达载体,分析其在B16细胞中的表达,研究OX40L对活化T淋巴细胞凋亡的影响。方法:以小鼠 C57BL/6脾脏的 cDNA为模板,PCR扩增小鼠 OX40L基因,构建真核表达载体 pVAX1-OX40L,转染 B16细胞后,荧光染色检测OX40L的表达;利用 AnnexinV-PE凋亡试剂盒,检测 B16黑素瘤细胞-淋巴细胞体外混合培养中对活化淋巴细胞凋亡的影响。结果:成功构建OX40L的真核表达载体,并转染B16细胞中,流式细胞术和激光共聚焦显微术均可检测到 OX40L表达 ### OX40L在小鼠B16黑素瘤细胞中表达及对活化淋巴细胞凋亡影响 #### 研究背景与意义 OX40L是一种重要的免疫调节分子，属于肿瘤坏死因子（TNF）家族成员之一。它通过与其受体OX40结合来调节免疫应答，在抗肿瘤免疫反应中发挥着重要作用。本研究旨在构建OX40L的真核表达载体，并分析其在B16黑素瘤细胞中的表达情况及其对活化T淋巴细胞凋亡的影响。 #### 研究目的 1. **构建OX40L的真核表达载体**：利用小鼠C57BL/6脾脏cDNA作为模板，通过PCR技术扩增小鼠OX40L基因，并将其构建入真核表达载体pVAX1中。 2. **检测OX40L在B16细胞中的表达**：将构建好的真核表达载体pVAX1-OX40L转染至B16黑素瘤细胞，并通过荧光染色法检测OX40L蛋白的表达。 3. **研究OX40L对活化T淋巴细胞凋亡的影响**：采用Annexin V-PE凋亡试剂盒检测B16黑素瘤细胞与淋巴细胞体外混合培养体系中，OX40L表达与否对活化淋巴细胞凋亡率的影响。 #### 实验材料与方法 - **材料**： - 小鼠C57BL/6脾脏cDNA：用于PCR扩增小鼠OX40L基因的模板。 - pVAX1载体：真核表达载体，用于构建表达OX40L基因的重组质粒。 - B16黑素瘤细胞：用于转染表达载体，观察OX40L蛋白的表达情况。 - 活化T淋巴细胞：用于检测凋亡情况。 - **方法**： - **PCR扩增OX40L基因**：以小鼠C57BL/6脾脏cDNA为模板进行PCR扩增，获得OX40L基因。 - **构建真核表达载体pVAX1-OX40L**：将扩增得到的OX40L基因克隆到pVAX1载体上，构建表达载体。 - **转染B16细胞**：使用脂质体等方法将pVAX1-OX40L载体转染至B16细胞中。 - **荧光染色检测OX40L表达**：转染后的B16细胞用特定抗体进行荧光染色，并通过流式细胞术和激光共聚焦显微镜检测OX40L蛋白的表达。 - **检测凋亡情况**：采用Annexin V-PE试剂盒检测B16细胞与淋巴细胞混合培养后活化淋巴细胞的凋亡率。 #### 结果 - 成功构建了OX40L的真核表达载体pVAX1-OX40L，并将其转染至B16细胞中。 - 荧光染色结果显示，OX40L蛋白在转染后的B16细胞表面有明显的表达。 - 在混合淋巴细胞培养体系中，与空质粒转染组相比，表达OX40L的B16细胞组活化淋巴细胞的凋亡率显著降低（6.57% vs 17.24%）。 #### 结论 该研究表明，OX40L能够成功地表达于B16细胞表面，并且能够显著抑制活化淋巴细胞的凋亡。这一发现为进一步探讨OX440L在抗肿瘤免疫治疗中的作用机制提供了实验基础。此外，该研究也为开发新的免疫治疗方法提供了潜在的靶点。