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目的探究初情期启动前、启动中、启动后大鼠下丘脑、垂体和卵巢中神经激肽B(Neurokinin B,NKB)的表达变化。方法以SD雌性大鼠为研究对象,分别取大鼠的下丘脑、垂体和卵巢组织制作冰冻切片,运用免疫荧光染色法检测SD大鼠下丘脑、垂体和卵巢上NKB的分布。结果NKB主要分布于各时期大鼠下丘脑的弓状核、腹内侧核、室旁核、腺垂体以及卵巢的黄体细胞、间质细胞。但NKB在不同时期表达水平不同,在初情期启动前(出生后25 d)和启动后(出生后60 d)表达最强,在初情期启动中最弱(P<0. 05)。同一时期不同
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第 4 3 卷 第 6 期
2015年 6 月
西北农林科技大学学报(自然科学版)
Journal of Northwest A & F University(Nat. S cC E d.)
Vol. 43 No. 6
Jun. 2015
网络出版时间:015-05-11 15 :03 D O I :10. 13207/j. cnki. jnwafu. 2015. 06. 023
网络出版地址:http://w w w . cnki. net/kcms/detail/61. 1390. S. 20150511. 1503. 023. html
神经激肽B 在大鼠下丘脑-垂体-卵巢轴上的表达
宋 爽 ,崔 培 ,王尧尧,蒋书东,章孝荣,方富贵,李福宝
(安徽农业大学动物科技学院,安徽合肥230036)
[摘 要 ] 【目的】探究初情期启动前、启动中、启动后大鼠下丘脑、垂体和卵巢中神经激肽B ( N e u r0k m m B ,
N K B ) 的表达变化。【方法】以 S D 雌性大鼠为研究对象,分别取大鼠的下丘脑、垂体和卵巢组织制作冰冻切片,运用
免疫荧光染色法检测S D 大鼠下丘脑、垂体和卵巢上N K B 的分布。【结果】N K B 主要分布于各时期大鼠下丘脑的弓
状核、腹内侧核、室旁核、腺垂体以及卵巢的黄体细胞、间质细胞。但 N K B 在不同时期表达水平不同,在初情期启动
前(出生后25 d)和启动后(出生后60 d)表达最强,在初情期启动中最弱(P < 0 . 05)。同一时期不同核团之间N K B 表
达水平也不同,初情期启动前和启动中室旁核最强,弓状核次之,腹内侧核最弱(P < 0 . 0 5 ) 在初情期启动后,弓状核和
腹内侧核中N K B 的表达显著高于室旁核(P < 0 . 0 5 ) 。腺垂体中N K B 在初情期启动时表达最强,初情期启动前次之,初
情期启动后最弱(P < 0 . 0 5 ) 。卵巢间质细胞中N K B 在初情期启动中的表达显著低于初情期启动前、后(P < 0 . 05)。卵
巢黄体细胞中N K B 在初情期启动后表达最强,初情期启动时最弱。【结论】N K B 可能与初情期启动的调控密切相关。
[关键词] 神经激肽B ; 初情期启动;大鼠;下丘脑;垂 体;卵巢
[ 中图分类号] S852. 1 [文献标志码] A [文章编号] 1 6 71-9387 (2015)06-0007-08
Expression of Neurokinin B in hypothalamus,pituitary and ovary of rats
SONG Shuang,CUI Pei, WANG Yao-yao, JIANG Shu-dong
,
ZHANG Xiao-rong,FANG Fu-gui,LI Fu-bao
(CoUege o/ Science and Tech^oiogy,Anhwi AgWcwitwraZ University ^ ^ e f ei^ 230036,China)
Abstrac t: 【Objective】 Th is st u dy a i m e d to investigate the c ha n ge in expression of N e u ro ki ni n B
( N K B ) in h y p o t h a l a m u s ,pituitary a n d ovar y of rats at p re p u b e r t y ,puberty-onset a n d post p u b er ty .【M e t h
o d 】 F e m a l e s S D rats w e r e selected a n d their h y p o t h a l a m u s ,pituitary a n d ova ry w e r e ta ke n for frozen sec
tion before i m m u no f l u o r es c en c e staining te ch no log y w a s us ed to detect the distribution of N K B i n h y p o -
t h a l a m u s ,pituitary a n d o va ry .【R e sul t 】 N K B w a s m ai n ly distributed in arcuate n u c le u s ,ventromed ial h y p o
thalamic nucleus, paraventricular nucleus of the hy p otha l am ic , ad e no h y p o p hy s is cells,a n d c o r p u s l u t e u m
cells a n d st r omal cells of ov ary of rats. Ex pr essi on intensity of N K B in h y p o t h a l a m u w a s different at differ
ent periods w it h the strongest expression at p repub erty ( on postnatal 25th day) a n d post pu ber ty ( on pos-
natal 60th day) ( P 〈 0. 05) a n d the w e a k e s t at puberty- onset ( P 〈 0. 05). Different nucles h a d different e x
pression levels at the s a m e t i m e ,at prep uber ty a n d puberty -onset the strongest e x p r e s s i o n w a s f ou n d in the
paraventricular nucleus followed b y arcuate n u cl e u s ,while the w e a k e s t w a s in the ventrome d ia l h y p o t h a
lamic nucleus ( P 〈 0. 05) ;while at post p u b e r t y ,the strongest expression w a s f ou nd in arcuate nucleus a nd
ventro me di al hy p o t hal am ic nu cl e us ,while the w e a k e s t expression w a s in the paraventricular nucleus. T h e
[收稿日期] 2014-01-01
[基金项目] 高等学校博士学科点专项科研基金博导类资助课题(20123418110004);安徽省自然科学基金项目(1208085MC39)
[作者简介] 宋 爽 (1986— ),女,河南南阳人,硕士,主要从事动物解剖与生殖内分泌研究。E-mail:shuangalice2011@163. com
[通信作者] 李福宝(953 — ),男,安徽固镇人,教授,主要从事动物解剖与生殖内分泌研究。E-mail:lfb@ahau. edu. cn
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西北农林科技大学学报(自然科学版)
第 4 3 卷
strongest expression intensity of N K B in pituitary w a s f o un d at puberty-onset, followed b y pr epub erty a n d
post p ub ert y ( P 〈 0. 05). Exp re ssi on intensity of N K B in s tromal cells of ov ar y at puberty-onset w a s signi--
icantly low er t han that at pre p ube r ty a n d post p ub erty ( P 〈 0. 05). T h e w e a k e s t expression intensity of
N K B w a s f o u n d at pub e rt y- on set,while the strongest expression w a s at post p ube rt y in stromal cells of o-
va r y. 【Co nclu sio n 】 N K B m a y be closely related to the control of p ub erty onset.
Key words : N K B ; pu ber ty onset; rats; hy p o th a l a m u s ; pituitary; ova ry
神 经 激 肽 B ( N e u r o k i n i n B ,N K B )又 名 神 经 介 素
K( Ne uro ki nin K ) ,是 速 激 肽 家 族 (Tachykinin family)
的一员[1]。N K B 是 K i m u r a 等 于 1 9 8 3 年 首 先 从 猪 脊
髓 中 分 离 出 来 的 含 有 1 0 个 氨 基 酸 的 多 肽 [2]。速 激 肽
家 族 主 要 由 P 物 质 (S P ) 、神 经 激 肽 A ( K 物 质 )和
N K B 组 成 。A m s t a l d e n 等 [3]通 过 对 I H H 患 者 进 行 遗
传 学 分 析 发 现 ,N K B 及 其 受 体 参 与 生 殖 调 控 。
初 情 期 的 启 动 是 动 物 获 得 繁 殖 能 力 的 标 志 ,初
情 期 启 动 始 于 下 丘 脑 促 性 腺 激 素 释 放 激 素 (G o n a -
dotropin r e l e as i ng h o rm o ne ,G n R H ) 脉 冲 式 分 泌 的
提 高 。研 究 显 示 ,动 物 胚 胎 早 期 G n R H 神 经 元 有 活
化 迹 象 ,随 后 进 人 休 眠 状 态 ,直 至 初 情 期 启 动 才 再 次
活 化 M 。应 用 免 疫 细 胞 化 学 法 结 合 腹 腔 注 射 荧 光 逆
行 示 踪 技 术 ,可 观 察 到 G n R H 神 经 元 纤 维 束 在 大 鼠
下 丘 脑 正 中 隆 起 处 与 N K B 免 疫 阳 性 纤 维 密 切 交
织 ,且 G n R H 神 经 元 轴 突 表 达 N K B 受 体 N K 3 R [3],
提 示 N K B 可 能 参 与 G n R H 神 经 元 的 再 次 活 化 ,从
而 启 动 初 情 期 。
目 前 关 于 N K B 在 大 鼠 [3]、绵 羊 [6]、猴 子 [7]、山
羊 M 、小 鼠 M 等 动 物 生 殖 轴 上 分 布 的 报 道 较 多 ,但 大
多 数 仅 涉 及 生 殖 轴 中 的 某 一 个 或 几 个 部 分 的 组 织 、
器 官 。另 外 ,关 于 生 殖 轴 上 N K B 的 分 布 及 表 达 量
仍 存 在 争 议 ,缺 少 对 生 殖 轴 整 体 的 研 究 ,而 关 于 初 情
期 启 动 前 后 动 物 生 殖 轴 上 N K B 的 表 达 变 化 更 是 鲜
有 报 道 。本 试 验 运 用 免 疫 荧 光 技 术 对 大 鼠 初 情 期 启
动 前 、启 动 中 、启 动 后 生 殖 轴 上 N K B 的 分 布 及 表 达
变 化 进 行 了 研 究 ,旨 在 为 N K B 在 初 情 期 启 动 中 的
调 控 作 用 研 究 提 供 形 态 学 依 据 。
1 材料与方法
1 . 1 试验动物
处 于 发 情 周 期 不 同 阶 段 的 S D 雌 性 大 鼠 1 5 只 ,
其 中 初 情 期 启 动 前 (出 生 后 25 d ) 初 情 期 启 动 中 (阴
门 开 启 )、初 情 期 启 动 后 (出 生 后 60 d ) [ln]各 5 只 。
1 . 2 采样及切片制作
麻 醉 处 死 大 鼠 ,取 下 丘 脑 、垂 体 、卵 巢 ,放 人 已 准
备 好 的 体 积 分 数 4 % 的 多 聚 甲 醛 固 定 液 中 ,固定
1 2 〜 24 h 后 取 出 ,经 0. 1 m o l / L P B S 充 分 洗 涤 后 ,
置 于 4 V 的 0. 3 g / m L 蔗 糖 溶 液 中 直 至 组 织 沉 底 ,
随 即 制 备 冰 冻 切 片 ,其 中 下 丘 脑 切 片 厚 度 25 ^ n ,垂
体 和 卵 巢 均 为 8 ^ m 。将 冰 冻 切 片 放 人 盛 有 0. 01
m o l / L P B S ( p H 7. 4 ) 的 6 孔 板 中 待 用 。
1 . 3 切片的免疫萸光染色
将 切 片 用 钩 环 捞 人 2 4 孔 板 用 于 免 疫 荧 光 染 色 。
切 片 用 P B S 浸 洗 3 次 ,每 次 10 m i n ,用 体 积 分 数 1 %
T r i to n( V (T r i t o n ) : V ( P B S ) = 1 : 9 9 )孵 育 1 0 〜 20
m i n , 用 0. 1 g / m L 牛 血 清 白 蛋 白 封 闭 15 m i n ,思 去
封 闭 液 ,加 人 N K B — 抗 (羊 抗 鼠 N K B ,S A N T A
C R U Z ,编 号 s c -1 4 1 09 ,稀 释 倍 数 1 : 2 0 0 ) ,置 于 湿 盒
内 4 °C孵 育 过 夜 。过 夜 孵 育 的 切 片 用 P B S 洗 3 次 ,
每 次 10 m i n ,加 人 二 抗 I g G t R (用 t R 标 记 的 兔 抗 山
羊 I g G ,S A N T A C R U Z ,编号 sc - 2 7 80 ,稀 释 倍 数 1 :
2 0 0 ) ,室 温 下 避 光 孵 育 2 h ,P B S 洗 3 次 ,每 次 10
m i n ,D A P I 染 核 2 m i n ,避 光 条 件 下 用 P B S 洗 3 次 ,
每 次 5 m i n ,将 组 织 切 片 置 于 滴 有 甘 油 的 载 玻 片 上 ,
盖 上 盖 玻 片 即 可 在 显 微 镜 下 观 察 。最 后 将 组 织 切 片
展 贴 于 载 玻 片 上 。试 验 设 置 阴 性 对 照 组 ,一 抗 用
P B S 替 代 ,其 他 步 骤 相 同 。
1 . 4 图像采集及分析
甘 油 封 片 后 置 于 荧 光 显 微 镜 (O L Y M P U S
D P 7 2 ,奥 林 巴 斯 )下 观 察 ,然 后 拍 照 。 运 用 I ma g e-
pro plus 6. 0 软 件 对 阳 性 区 域 平 均 光 密 度 值 (0 6即卜
ty m e a n ) 进 行 分 析 。平 均 光 密 度 值 用 “平 均 值 士 标
准 差 ”表 示 ,采 用 t 检 验 分 析 差 异 显 著 性 。
2 结果与分析
2.1 N K B 在初情期启动前后大鼠下丘脑中的表达
免 疫 荧 光 显 示 ,N K B 免 疫 反 应 阳 性 细 胞 在 荧 光
显 微 镜 下 有 橙 红 色 荧 光 ,阴 性 对 照 组 无 荧 光 。不同
发 育 时 期 所 有 大 鼠 下 丘 脑 的 弓 状 核 、腹 内 侧 核 、室旁
核 均 有 N K B 表 达 (图 1 ) 。 由 表 1 可 知 ,不 同 时 期 的
同 一 核 团 平 均 光 密 度 值 不 同 。初 情 期 启 动 中 ,N K B
在 各 个 核 团 上 的 表 达 显 著 低 于 初 情 期 启 动 前 (P <
0. 0 5 ) ;在 弓 状 核 和 室 旁 核 的 表 达 显 著 高 于 初 情 期 启
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