乌司他丁对大鼠肾脏机械性损伤后肾脏HSP70、IL-6表达的早期影响资源-CSDN文库

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乌司他丁对大鼠肾脏机械性损伤后肾脏 HSP70、IL-6

表达的早期影响

毛渭东，孙少华

兰州大学第一医院病理研究所，兰州（730000）

E-mail：maowdong056@sina.com

摘要：目的探讨乌司他丁(ulinastatin，UTI)在大鼠肾脏机械性损伤后对肾脏白细胞介素

6（Interleukin-6，IL-6）和热休克蛋白 70（Heat shock protein 70,HSP70）表达的影响及意义。

方法成年雌性 Wistar 大鼠 66 只，随机分为非创伤对照组(C 组)、单纯创伤组(T 组)、创伤

后给予乌司他丁组(U 组)。采用自由落体生物撞击仪撞击大鼠脊肋角复制创伤动物模型。用

组织芯片技术及免疫组织化学方法检测各组创伤后

1 h

、

6 h

、

12 h

、

24 h

、3

6 h

点肾脏组织中

IL-6 和 HSP70 蛋白的表达。结果对照组肾脏组织中 IL-6 和 HSP70 蛋白均呈弱阳性表达。

与对照组比较，单纯创伤组在创伤后 1、6、12、24 h 点 IL-6 表达明显增强（P<0.05），6 h

点 HSP70 表达明显增强（P<0.05）。创伤后注射乌司他丁组各时相点肾组织中 IL-6 表达明显

低于单纯创伤组（P<0.05），HSP70 表达在 1、24、36 h 点明显高于单纯创伤组（以

1 h

点为

著，P<0.05）。结论乌司他丁通过抑制 IL-6 的过度表达，上调 HSP70 的表达，在创伤早期(以

1 h

点

为著)对大鼠肾脏起保护性作用。

关键词：肾脏；创伤；乌司他丁；IL-6；HSP70

中图分类号：R641 文献标识码：A

1. 引言

近年来，随着交通工具的增多和体育运动的发展，创伤的发病率有明显增加的局势。

WHO预计，至2020年，道路交通伤致死和致残人数将在全球疾病和伤害中排名第三位

[1]

。

创伤后常合并多脏器的损害，其中肾脏作为机体的一种外分泌器官，同时又是重要的内分泌

器官，故对肾脏创伤的研究显得尤为重要。乌司他丁作为广谱蛋白酶抑制剂

[2]

，已广泛用于

临床，在治疗急性胰腺炎、改善微循环、减轻手术对器官的损伤等方面显示出极强的脏器保

护功能。乌司他丁的药理作用针对由水解酶、过度炎症反应、缺血和缺氧等造成的组织细胞

损害, 并显示了确切的脏器保护疗效

[3]

。乌司他丁在肾移植领域亦已广泛应用。邓文峰等

[4]

研究表明, 对于移植肾热缺血时间8～12 min的肾移植患者,与对照组相比,乌司他丁组能有效

促进移植肾功能恢复。本研究通过复制大鼠肾脏机械性损伤模型，检测创伤后早期肾脏组织

中HSP70及IL-6的分布及含量，观察乌司他丁对肾脏创伤后的早期保护性作用。

2. 材料和方法

2.1 材料

成年健康雌性 Wistar 大鼠 66 只，由兰州大学实验动物中心提供，动物质量合格证编号

为兰大动检（06）第 004 号，体质量（180±20）g。随机分为非创伤对照组(C 组)、单纯创

伤组(T 组)和创伤后给予乌司他丁组(U 组)，后两组再根据处死时间分为

1 h

、

6 h

、

12 h

、

24 h

、

36 h

五个亚组，每组均 6 只。饲养于环境恒定的房间内,定时供给食物和水。乌司他丁

(ulinastatin, UTI)购自广东天普生化医药股份有限公司（批准文号：国药准字 H19990134）。免

疫组化染色一抗采用的兔抗大鼠 IL-6 多克隆抗体、兔抗大鼠 HSP70 多克隆抗体均购自武汉

博士德生物工程有限公司，二抗采用上述公司的即用型 SABC 免疫组化试剂盒。自由落体

生物撞击仪由兰州大学第一医院病理研究所设计研制

[5]

，其它辅助试剂由兰州大学第一医院

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病理研究所提供。

2.2 方法

2.2.1 动物模型的建立

动物经

40 m

l/L 水合氯醛（

8 m

l/kg）腹腔注射轻度麻醉肌肉松弛后，采用自由落体生物

撞击仪打击大鼠脊肋角制作肾脏创伤模型。以 140 g 铁制重物从 50 cm 高度自由下落打击大

鼠脊肋角，打击面为圆形，直径 1

.0 cm

，下压距离 0

.8 cm

。可造成 I 级或未达 I 级损伤（按

美国创伤外科科学会器官损伤标准委员会指定的肾脏损伤标准）

[6]

，镜下观察选择标准是

组织中不出现出血灶，但有红细胞管型。各组肾脏经 HE 染色病理组织切片观察后符合肾脏

Ⅰ级损伤标准。T 组及 U 组分别于创伤后

1 h

、

6 h

、

12 h

、

24 h

、

36 h

颈椎脱臼法处死各 6 只。

U 组于创伤后

10 min

腹腔注射乌司他丁（4 万 u/kg 体重，浓度为 2.5 万 u/ml）。C 组于麻醉

后 1 h 颈椎脱臼法处死。处死后常规解剖大鼠提取肾脏标本，立即置于

40 g

/L 甲醛溶液中固

定，48 h 后取材，常规做肾脏组织 HE 染色和免疫组织化学染色。

2.2.2 组织芯片技术

肾脏组织 HE 染色切片在显微镜下对病变明显部位进行观察定位，在相对应的石蜡蜡块

选好部位，用组织取样针钻取相应组织条（圆柱形，直径 2

.0 mm

），按照设计好的顺序和数

量依次置入受体蜡块的钻孔中（按 5×7 矩阵排列，单孔直径

2.1 mm

），然后对放满组织条的

受体蜡块进行二次熔蜡包埋处理，切制白片待用。

2.2.3 免疫组织化学法检测组织芯片肾脏组织中 IL-6 及 HSP70 的表达

对制备好的组织芯片进行免疫组织化学染色。染色步骤严格按照试剂盒的说明进行。采

用 SABC 法。 IL-6 及 HSP70 一抗浓度均为 1:100。二氨基联苯（DAB）显色。结果判定：

IL-6 及 HSP70 阳性结果为细胞质均呈棕黄色。阴性对照用 PBS 代替一抗。采用四川大学图

象图形研究所 Mias 图象分析系统对免疫组织化学指标进行阳性目标灰度值测量（阳性表达

越强，其目标灰度值越低）。

2.2.4 统计学处理

采用 SPSS13.0 统计学软件对实验数据进行处理，数据用

±s 表示，组间比较用单因素

方差分析中的 LSD 分析。IL-6、HSP70 免疫组化结果进一步进行 Spearman 等级相关分析。

P<0.05 为差异有统计学意义。

3. 结果

3.1 肾脏 HE 染色结果

C 组肾小球、肾小管结构正常。创伤后肾脏病变主要位于皮质肾小管，肾小球无明显病

理性改变。多数肾小管上皮细胞出现胞浆疏松化及空泡样改变。部分近曲小管上皮细胞扁平，

刷状缘脱落，个别上皮细胞脱落，基底膜尚完整，肾小管结构轮廓清楚(Img1)。以上肾小管

病变以创伤后 1h 最为显著，并随着时间推移呈现明显减轻趋势。

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