第 ２９ 卷第 １０ 期 西 南 大 学 学 报 （自然科学版） ２００７年１０月
Ｖｏｌ畅２９ Ｎｏ畅１０ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ （Ｎａｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｅｄｉｔｉｏｎ） Ｏｃｔ畅 ２００７
文章编号 ：１６７３ ９８６８（２００７）１０ ０１２９ ０５
菜 心 ＩＳＳＲ‐ＰＣＲ 反 应 体 系 的 优 化
①
孙雪梅
１ ，２
， 乔爱民
２
， 孙 敏
１
， 桂腾琴
１ ，２
１畅 西南大学 生命科学学院 ，重庆 ４００７１５ ；２畅 仲恺农业技术学院 农业与园林学院 ，广州 ５１０２２５
摘要 ：以菜心（Ｂ ｒａｓｓｉｃａ ｃａｍ
ｐ
ｅｓｔｒｉｓ Ｌ畅 ｓｓｐ畅 Ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ Ｖａｒ畅 ｕｔｉｌｉｓ Ｔｓｓｅｎ畅 ｅｔ Ｌｅｅ畅 ）为材料 ，对影响 ＩＳＳＲ‐ＰＣＲ 扩增结
果的因素如 Ｍｇ
２ ＋
、 Ｔ ａ
ｑ
ＤＮＡ 聚合酶 、ｄＮＴＰｓ 、Ｐｒｉｍｅｒ 、模版 ＤＮＡ 的浓度及引物退火温度 、延伸时间和循环次数进
行了探讨 ，确立了适合菜心 ＩＳＳＲ‐ＰＣＲ 分析的最佳反应体系和 ＰＣＲ 扩增参数 ：在 ２５
μ
Ｌ 反应体系中含 １０ × ｂｕｆｆｅｒ
２畅５
μ
Ｌ ，２畅０ ｍｍｏｌ／Ｌ Ｍｇ
２ ＋
，０畅 ５ Ｕ Ｔ ａ
ｑ
ＤＮＡ 聚合酶 ，０畅 ２ ｍｍｏｌ／Ｌ ｄＮＴＰｓ ，０畅５
μ
ｍｏｌ／Ｌ 引物 ，３０ ｎｇ 模板 ＤＮＡ ．
ＰＣＲ 扩增程序 ：９４ ℃ 预变性 ３ ｍｉｎ ；９４ ℃ 变性 １ ｍｉｎ ，４９畅７ ～ ５６ ℃ 退火（退火温度随引物不同而定）１ ｍｉｎ ，７２ ℃ 延
伸 ４５ ｓ ，４０ 个循环 ；７２ ℃ 延伸 ５ ｍｉｎ ．
关 键 词 ： 菜心 ；简单序列重复间区 （ＩＳＳＲ） ；反应体系
中图分类号 ：
Ｑ
７８９ 文献标识码 ： Ａ
ＩＳＳＲ 是 Ｚｉｅｔｋｉｅｗｉｃｚ 等
［１］
于 １９９４ 年创建的基于 ＰＣＲ 的一种新微卫星类分子标记 ．ＩＳＳＲ 标记为显性标
记 ，符合孟德尔遗传规律 ，遗传多态性高 ，重复性好 ，实验操作简单 、快速 ，结合了 ＲＡＰＤ 标记技术和 ＳＳＲ
标记技术的优点 ．ＩＳＳＲ 技术现已广泛应用于大麦 、小麦 、水稻 、马铃薯等农作物的研究
［２ ４］
．
菜心（Ｂ ｒａｓｓｉｃａ ｃａｍ
ｐ
ｅｓｔｒｉｓ Ｌ畅 ｓｓｐ畅 Ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ Ｖａｒ畅 ｕｔｉｌｉｓ Ｔｓｓｅｎ畅 ｅｔ Ｌｅｅ畅 ） ，又称菜薹 ，是十字花科芸薹
属芸薹种白菜亚种中以花薹为产品的变种 ．本研究以菜心的基因组 ＤＮＡ 为模板 ，探讨 ＩＳＳＲ‐ＰＣＲ 反应体
系中各种因素对其扩增的影响 ，以期获得菜心 ＩＳＳＲ 反应的最佳体系 ，为菜心种质资源的科学利用和分子
标记辅助育种等方面提供可靠的技术支持 ．
１ 材料与方法
１畅１ 材 料
菜心种子（由广东省农科院提供）在温水中浸泡 ２０ ｍｉｎ 后 ，将其点播在培养皿中 （培养皿中垫有两层浸
湿的滤纸） ，放入培养箱中 ２７ ℃ 暗培养至长出 ３ ｃｍ 高的黄化苗作为供试材料 ．
１畅２ 方 法
１畅２畅１ ＤＮＡ 的提取
采用改良的 ＣＴＡＢ 法提取 ＤＮＡ ，紫外分光光度计检测其质量和浓度 ，最后稀释标定为 ２０ ｎｇ／μＬ ，放
入 － ２０ ℃ 冰箱里备用 ．
１畅２畅２ ＩＳＳＲ 反应条件优化
试验流程参照沈金雄
［５］
的扩增反应体系 ，反应体系总体积为 ２５
μ
Ｌ ．本试验用引物 ＡＦ７７１３０ 对 ＩＳＳＲ
反应的影响因素（Ｍｇ
２ ＋
，Ｔ ａ
ｑ
ＤＮＡ 聚合酶 ，ｄＮ ＴＰｓ ，Ｐｒｉｍｅｒ ，模板 ＤＮＡ 的浓度 ，退火温度 ，反应循环数 ，
①
收稿日期 ： ２００７ ０４ ０３
基金项目 ： 广东省自然科学基金资助项目（Ｂ１０１０４１２） ．
作者简介 ： 孙雪梅（１９８１ ） ，女 ，四川广元人 ，硕士研究生 ，主要从事植物学与植物生物技术研究工作 ．
通讯作者 ：乔爱民 ，教授 ，硕士生导师 ．
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