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以原人参二醇型皂苷混合物为底物对10种霉菌进行筛选,发现3.26号菌株能够将高含量的原人参二醇型皂苷Rb1、Rb2、Rc等转化为具有抗肿瘤活性的稀有人参皂苷Compound K(C-K)。经形态学和ITS序列分析鉴定,该菌株属于附球霉属(Epicoccum)真菌。从该菌株培养液中分离出人参皂苷水解酶粗酶E-I,确定其最适pH值和最适温度分别为pH 5.0和40 ℃。用E- I分别转化人参皂苷Rb1和Rb2、Rc,发现它既能水解人参皂苷Rb1,也能水解Rb2和Rc,但是对 Rb1的水解活性更强。上述结果说明
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噩噩罩噩噩
稀有人参皂音
C-K
转化菌株的
筛选鉴定及其转化特性
赵雪和毛
梁飞
2
胡彦波
2
梦月
2
周义发
2
(1.
辽宁仁程技术大学矿业学|驼,
.i
辽
γ
阜新
123000;2
东北
V
!l
i
范大学生命科学学院,
r
吉林长春
130024)
摘要:以原人参二醇型皂普混合物为底物对
10
种霉菌进行筛选,发现
3.26
号菌株能够将高含
量的原人参二醇型皂爷
Rb
h
Rb
2
、
Rc
等转化为具有抗肿瘤活性的稀有人参皂爷
Compound
K
(C-K)
。经形态学和
ITS
序列分析鉴定,该菌株属于附球霉属
(Epicoccum)
具菌。从该菌株培养液
中分离出人参皂苦水解酶粗酶
E-I
,确定其最适
pH
值和最适温度分别为
pH
5.0
和
40
"c。用
E
I
分别转化人参皂普
Rb
I
和
Rb
2
、
Rc
,发现它既能水解人参皂普
Rb
I
,也能水解
Rb
2
和
Rc
,但是对
Rb
I
的水解活性更强。上述结果说明
:3.26
号菌株产生的糖普酶具有广泛的底物专一性,但是对
葡萄糖普键的专一性更高;该茵的生物转化途径为人参皂普Rb
h
Rb
2
、
Rc
→
Rd
→
Fi
→
C-K
。
关键词:人参皂苦,人参皂普
C-K
,生物转化,筛选,
ITS
序列分析
中图分类号
:Q
815
文献标志码
:A
文章编号:1
673
一
1689(2013)09--0914
一
07
Screening, Identification and Transformational Property of
Minor Ginsenoside Compound K-Producing Fungus
ZHAOXue-soni
,
LIANGFei2
,
HUYan-bo
2
,
MENGYue
2
,
ZHOUYi
手后
(1.
College
of
Mining
Industry
,
Liaoning
Technical
University
,
Fuxin
123000
, China;
2.
School
of
Life
Sciences
,
Northeast
Normal
University
,
Changchun
130024
, China)
Abstract:
Ten
fungi were screened with regard to
their
ability to convert major saponins
Rb
1
,
Rb
2
and
Rc
to Compound K
(C-K)
which has notable
anti-tumor
activity. Among these , strain sp.
3.26
exhibited highest transfer ability. The strain sp.
3.26
was identified as Epicoccum sp. through ITS
sequence
analysis and morphology observation. A
crude
ginsenoside-hydrolyzing
ß-glucosidase
(E-
1)
was isolated from a culture filtrate of the strain sp. 3.26. The optimal
pH
and
temperature of
E-I
were
pH
5.0
and
40
"C
,respectively.
E-I
not only hydrolyze ginsenoside Rb
1
but
also hydrolyze Rb
2
and
Rc. However,
E-I
has higher activity
to
Rb
l
•
This result
indicated
that the glycosidases secreted
by strain sp.
3.26
has wide substrate specificity ,
and
was more specific to glucosidic linkage ,
and
the biotransformation pathways by this strain was: ginsenosides Rb
I
,
Rb
2
,
Rc
•
Rd
•
Fi
•
C-K.
收稿日期:
2013-04-15
基金项目·罔家自然科学基金项口
(31270479)
。
作者简介.赵雪淤(l
971~)
,女,满族,黑龙江五常人,理学博士,副教授,主要从事植物与微生物相互作用研究。
E-mail:
zhaoxs210@163.com
o Journal
of
Food
Science
and
Bi
otechnology
Vo
l.32
No.9
2013
EE
噩噩
赵雪叶去,等:稀有人参皂菩
C-K
转化茵株的筛选鉴定及其转化特性
Keywords:
ginsenosides , compound K, biotransformation ,screening,
ITS
sequence analysis
人参是百草之王,在我同已有
2000
多年的药
用历史,具有多种药理学活性,对神经系统、内分泌
系统、循环系统及免疫系统等均有作用
O
人参皂昔
是人参的主要活性成分,从人参中分离出的人参皂
甘有
40
余种
[11
。近年来的研究发现,有些在人参中
含量很低的稀有人参皂背如
Rg
3
、
C-K
、
Rh
2
等具有
优异的抗肿瘤活性,可抑制肿瘤细胞的增殖,抑制
癌细胞转移、诱导肿瘤细胞凋亡和抗肿瘤诱导的血
管新生等,有重要的药用价值间。但是,稀有人参皂
昔在人参中的含量太低,无法从人参中直接提取,
而现有的化学合成技术还无法实现工业化生产,因
此,如何高效大量制备稀有人参皂昔成为科学研究
的焦点。
稀有人参皂昔的化学结构与人参中某些含量
高的人参皂昔(如
Rb
l
)
相比,只是缺少了→个或几
个糖基。理论上可以通过改变某些高含量人参皂昔
的结构来获得稀有人参皂背。结构修饰的方法主要
有化学转化法和生物转化法。生物转化法具有反应
条件温和、专一性强、得率高等优点,是获得稀有人
参皂昔的有效途径,而优良菌种或菌株的筛选是生
物转化成败的关键因素闷。人参中含量最高的人参
皂昔是
Rb
l
,其糖基的连接键为日一葡萄糖昔键,微
生物中户一葡萄糖昔酶酶活高的菌种主要是霉菌
Iη
,
因此霉菌是筛选转化菌株的良好来源。在作者所在
研究团队以前的研究中,已经发现了→些优良的稀
有人参皂昔转化菌株及其转化酶
[8-10]
。作者从
10
种
霉菌中筛选出
1
种能转化高含量的原人参二醇型
皂昔为稀有人参皂昔
C-K
的菌株,并结合形态学和
分子生物学技术进行了菌种鉴定,继而研究了该菌
的转化特性。研究结果为稀有人参皂昔
C-K
的大量
制备奠定了基础。
-.!i
l
i!!噩噩噩-蜡器
1.
1
材料与试剂
10
种霉菌,采自长春市郊茄科植物病原组织,
PDA
培养基
4
"C暗保存;人参皂昔标准品,购自成
都曼斯特生物技术有限公司·人参皂昔混合物及人
参皂昔单体,由作者所在实验室制备,具体制备方
法参见文献
[11]
j DNA marker ,
Invitrogen
公司提供;
凝胶回收试剂盒,
QIAGEN
公司提供
jCTAB
,
Amresco
公司提供;氯仿、甲醇等化学试剂,均为北
京化工厂生产。
1.
2
仪器与设备
BCN
一
1360B
生物超净工作台,北京东联哈尔仪
器制造有限公司制造
j
YXQ-LS-30SII
立式压力蒸
汽灭菌器,上海博讯实业公司制造
jHZQ-C
空气浴
振荡器,哈尔滨市东明医疗仪器厂制造
jZ36HK
低
温高速离心机,德国
Hermle
制造;倒置荧光显微镜,
日本Ol
ympus
制造
jDYCP-3
1D水平电泳槽,北京
市六一仪器厂制造;紫外/可见凝胶成像系统
UVltec
制造
jPCR
仪,
ABI
公司制造。
1.
3
方法
1.3.1
分析方法
TLC
分析采用
G
60
硅胶板,展
开剂
CHCb-MeOH-H
2
0(
体积比
65:35:10
,下层)。显
色剂为体积分数
5%
硫酸乙醇,
105
"C加热
5
min
。展
开方式为上行展开。
1.
3.2
人参皂爷转化茵林的筛选
供试菌种置于
V8
汁液体培养基中振荡培养,
130
r/min , 28
"C,培
养
8
d
后,纱布过滤,
8
000
g
、
4
"C、离心
20 min
,弃
去上清,得到抱子。将于包子悬浮在
20
mmol/L
醋酸
醋酸铀缓冲液
(pH
5.0)
中,在
130
r/
min
、
28
"c条件
下振荡培养
24
h
,然后加入人参皂昔储备液(人参
皂昔样品溶于
pH
5.0
20
mmo
l/
L
的醋酸一醋酸铀缓
冲液中并通过
0
.2
μm
的滤膜过滤除菌)
,使子包子的
终浓度为
5xl0
6
个
/mL
底物的终质量浓度为
0
.2
5
mg/mL
,继续振荡培养
0-5
d
。从加入人参皂昔的
O
时开始取样,每隔
24
h
取样一次,加入等体积的正
丁醇萃取,上层正丁醇相减压蒸干,重新溶于质量
分数
40%
乙睛水榕液中,
TLC
检测转化结果。
1.
3.3
菌种形态鉴定
PDA
培养基接种
3
.2
6
号霉
菌,
30
"c恒温培养,观察菌落的形态、颜色;挑取菌
丝,
"Z"
型接种,用灭菌的盖玻片垂直
"Z"
线插入到
培养基中培养,取盖玻片显微观察。
1.3.4
菌种分子生物学鉴定
鉴定采用
rDNA-
ITS
(1 8S
rRNA
基因
-ITS)
序列分析方法。具体方法为:
V8
汁液体培养基(1
L
培养基含有
200
mL
V8
汁和
2 g
CaC0
3
)30
"c振荡培养
3.26
号菌株
5
d
,取菌丝
体预冻后加液氮研磨,
CTAB
法提取霉菌
DNA
,质量
食品与生物技术学报
2013
年第
32
卷第
9
期
G
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