pET系统操作手册

《pET系统操作手册》是关于蛋白表达技术的专业文献，主要涵盖了pET系列的所有系统，包括标签、序列和酶切位点等关键信息。pET系统是常用的原核表达系统，主要用于在大肠杆菌中高效表达目的蛋白质。下面将详细阐述pET系统的关键组成部分和操作要点。 pET系统中的“pET-3b”、“pET-3c”和“pET-3d”是三种不同的载体，它们都带有N-末端的T7•Tag序列和BamH I克隆位点。T7•Tag序列是一个短肽标签，能够帮助识别和纯化表达的蛋白质。BamH I是一种限制性内切酶，常用于插入外源DNA片段。值得注意的是，pET-3b、pET-3c和pET-3d的大小分别不同，这主要由于BamH I切割位点之后的差异导致。 pET-3a-d系列载体是pET家族的一部分，其中pET-23a-d(+)系列在pET-3a-d的基础上增加了额外的功能。这些载体的地图显示了独特的酶切位点，对于克隆和表达操作至关重要。T7启动子位于615-631位，是T7 RNA聚合酶启动转录的起点。T7•Tag编码序列从519到551，而T7终止子则位于404-450位。这些序列的编号遵循pBR322的常规，因此在环状地图上，T7表达区域是反向的。 编码区域由T7 RNA聚合酶转录，下方展示了这部分序列。pET-3b、3c和3d的图谱与pET-3a基本一致，但有以下区别：pET-3b是4639bp的质粒，BamH I位点之后的每个位点减去1bp；pET-3c是4638bp，减去2bp；pET-3d是4637bp，BamH I位点与pET-3c同框，但用Nco I替代了Nde I位点。 在实际操作中，使用者需要根据目的基因的特性和实验需求选择合适的pET载体，并利用限制性内切酶进行克隆。T7启动子的强启动活性使得目的基因能够得到高效的转录，T7•Tag序列则为后续的蛋白质纯化提供了便利。此外，质粒上的bla基因编码β-内酰胺酶，提供了对抗生素的抗性，以便于质粒的筛选和维持。 pET系统是一个强大的工具，用于原核细胞中的蛋白表达。通过理解这些载体的结构和特性，科研人员可以有效地克隆、表达和纯化目标蛋白质，从而推动生物化学、分子生物学和药物研发等领域的工作。在使用pET系统时，需注意选择合适的载体，正确进行酶切和连接操作，并遵循克隆和表达的标准化流程，以确保实验的成功。