Merk-pET_System_Manual.pdf

根据提供的文件信息，可以推断这份文件是一份关于pET系统操作手册的内容，这个系统是使用大肠杆菌（E. coli）作为宿主细胞来表达蛋白。大肠杆菌作为宿主细胞具有生长速度快和蛋白表达量高的优点。本手册提供了一整套实验指南，涵盖了从基因克隆到蛋白纯化的全过程。由于文件是扫描而来的，部分文字可能有识别错误或缺失，以下将基于已识别的内容提取和解释相关知识点。 知识点： 1. 大肠杆菌表达系统：这是目前最常用于外源蛋白表达的宿主系统之一，其特点包括遗传背景清晰，基因操作简单，生长快，成本低，以及可以进行高密度培养等。 2. pET系统：这是一个广泛使用的原核表达系统，由Novagen公司开发，利用大肠杆菌作为宿主细胞。pET表达载体含有T7 RNA聚合酶特异的启动子，可实现高度特异的蛋白质表达。 3. T7 RNA聚合酶：这是由T7噬菌体基因编码的一种RNA聚合酶，在宿主细胞大肠杆菌中，它可以特异性地启动下游基因的转录，实现高效的外源基因表达。 4. T7启动子：这是一个强启动子，由T7噬菌体提供，能够被T7 RNA聚合酶识别并驱动基因转录。 5. pLac启动子：这是一个受到 IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷）诱导的启动子，用于调节基因的表达。 6. pLysS和pLysE：这两个是带有λ噬菌体裂解基因的宿主菌株，可以用来控制T7 RNA聚合酶的表达，从而控制目的蛋白的表达水平，防止细胞因过量表达蛋白而破裂。 7. pETcoco™：这是Novagen公司开发的一种特殊pET载体，用于同时表达目标蛋白和伴侣蛋白，以提高可溶性蛋白的产量。 8. SDS-PAGE：这是一种基于聚丙烯酰胺凝胶电泳的技术，用于分离和分析蛋白质，是蛋白质研究中常用的技术之一。 9. BugBuster®、Benzonase®、rLysozyme™：这些是Novagen公司提供的用于细胞破碎的试剂，能够有效释放细胞内的蛋白。 10. His·Tag、GST·Tag、S·Tag、HSV·Tag、Nus·Tag等：这些是常见的蛋白标签，它们可以与外源蛋白融合，以便于纯化和检测。 11. Western Blot：这是一种用于蛋白质检测的实验技术，通过特定抗体识别并检测蛋白质。 12. LIC（ligation-independent cloning）：这是一种无需用限制性内切酶处理和连接的基因克隆方法，简化了克隆过程，提高了克隆效率。 13. 载体选择：pET系统提供了多种载体，用户可以根据自己的需求选择合适的载体进行蛋白表达。例如，pET-21a(+)、pET-24a(+)、pET-23a(+)等，它们具有不同的标签和抗性标记。 14. 表达宿主菌株：包括BL21、BL21(DE3)、NovaBlue等，这些菌株具有不同的特点，如高表达量、低背景等，用户可以根据实验目的选择合适的宿主菌株。 本手册提供的信息非常详尽，适合需要在大肠杆菌表达系统中进行蛋白表达的科研人员使用。它不仅包括了表达载体的构建，还有蛋白表达、纯化和检测的详细步骤，帮助用户更好地进行实验操作。通过这份手册，读者可以了解到如何使用pET系统表达目的蛋白，并进行进一步的分析和研究。