基于ARTP和适应性进化选育高抗逆性凝结芽孢杆菌及其发酵豆粕的研究.doc
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2023-09-10
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摘 要
凝结芽孢杆菌（Bacillus coagulans）是一种兼具乳酸菌和芽孢杆菌优势的益
生菌，相比于其他菌群，其芽孢体对热、酸、碱、盐等不敏感，可经受高温加工、
胃肠道酸碱环境，有效降低染杂菌风险，目前已成为饲料领域微生态制剂的优势
菌群之一。然而，并非所有天然存在的凝结芽孢杆菌都对酸、碱、盐等压力环境
具有优良的抵抗性能。因此，在前期已成功从健康猪肠道内容物分离纯化并鉴定
出一株凝结芽孢杆菌，命名为 WT-03 的基础上，本研究利用常压室温等离子体
诱变(Atmospheric and room temperature plasma, ARTP) 结合适应性进化 (Adaptive
laboratory evolution, ALE ) 策略对其进行抗逆性能改善，筛选具备耐酸、耐胆盐
等高抗逆性的目的菌株，并从胞内微环境、细胞结构以及细胞膜层面对其抗逆性
机制进行初步探究；最后，将其用于固态发酵豆粕，优化发酵条件，对发酵前后
的营养品质进行评价。
主要研究内容有：
（1）采用 ARTP 结合适应性进化选育了耐酸、耐胆盐的高抗逆性凝结芽孢
杆菌。ARTP 最优照射时间为 15s，致死率 93.84%。利用含 0.3%(w/v)胆盐的 MRS
筛选培养基对诱变 15s 的菌体进行初筛，得到 30 株生长态势良好、菌落较大的
突变株 artp-BC1、artp-BC2……artp-BC30。之后，利用盛有 pH4.0、pH3.5 和
pH3.0 的 24 孔板液体培养基对初筛菌进行复筛，最终得到 artp-BC5、artp-BC15、
artp-BC28 三株突变株，在 pH3.0 存活率显著高于野生株，分别为 18.2%、18.8%
和 19.3%。40d 的梯度酸驯化实验显示，artp-aleBC15 在 pH2.5 存活率最大，为
19.8%；而对照菌 WT-03 仅为 7.15%。体外模拟胃肠道实验表明，artp-aleBC15、
artp-BC15 和 WT-03 最 终 存 活 率 分 别 为 20.5% 、 15.2% 和 7.98% 。 因 此 ，
artp-aleBC15 为 理 想 菌 株 ， 已 存 于 中 国 工 业 微 生 物 菌 种 保 藏 中 心 ， 编 号
CGMCC1.17145。
（2）从胞内微环境变化、细胞结构和细胞膜水平对凝结芽孢杆菌突变株和
野生株的耐酸性机理进行了探究。外界酸胁迫导致胞内 pH（pHi）降低，pH6.2
时，artp-aleBC15、artp-BC15 和对照组 WT-03 的 pHi 均在 7.10 左右；而 pH2.5
时，突变株 artp-aleBC15、artp-BC15 和对照株 WT-03 的 pHi 分别为 4.90、4.45
和 4.23。扫描电镜结果表明，artp-aleBC15 在 pH2.5 环境能更好的保持结构完整
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