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PCR实验报告 7月19日 高遄 实验目的：了解PCR技术原理，掌握最基础的PCR实验步骤。 实验试剂：模板DNA，Mg2+，buffer，dNTPs，Taq DNA聚合酶，引物，H2O，石蜡油。 实验原理： PCR全称聚合酶链反应，是体外快速扩增特定基因或DNA序列最常用的方法。 基本原理：首先将双链DNA分子在临近沸点的温度下加热分离成2条单链DNA分子，D NA聚合酶以单链DNA为模板并利用反应混合物中的四种脱氧核苷三磷酸合成新的D NA互补链。PCR反应时，只要在试管内加入模板DNA、PCR引物、四种核苷酸及适当 浓度的Mg2+，DNA聚合酶就能在数小时内将目标序列扩增100万倍以上。 1. 双链模板DNA分子首先在高温下解开成长的单链，短链引物分子立即与该模板DNA两端 的特定序列相结合，产生双链区。 2. DNA聚合酶从引物处开始复制其互补链，迅速产生与目标序列完全相同的复制品。 3. 在后续反应中，无论是起始模板DNA还是经复制的杂合DNA双链，都会在高温下解开成 为单链，体系中的引物分子再次与其互补序列相结合，聚合酶也再度复制模板DNA。 4. 由于在PCR反应中选用的一对引物，是按照与扩增区域两端序列彼此互补的原则设计的 ，因此每一条新生链的合成都是从引物的退火结合位点开始并朝反方向延伸的，每 一条新合成的DNA链上都有新的引物结合位点。 5. 整个PCR的反应全过程，即DNA解链（变性）、引物与模板DNA结合（退火）、DNA合成 （链的延伸）三步可以被不断重复。经多次循环之后，反应混合物中所含有的双链 DNA分子数，即两条引物结合位点之间的DNA区段的拷贝数，理论上的最高值应该是 2^n，能进一步满足遗传分析的需要。 试剂作用： 1. 引物：DNA复制的起始点，针对复制DNA片段的两端，有5'引物和3'引物 2. Taq DNA聚合酶：促进dNTPs与模板结合。 3. Buffer：Tris-HCl反应缓冲液，Taq DNA聚合酶提供一个最适酶催反应条件。 4. Mg2+：对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特异性，浓度过低则影响 PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。 5. dNTPs：底物，在引物引导下合成与模板互补的DNA新链。 6. 石蜡油：防止PCR加热过程中DNA蒸发。 试剂配置体积： 20μl体系中各试剂配置如下表： "试剂 "H2O "Buffer "Mg2+ "dNTPs "P（引物"T（模板"E（酶）" " " " " " "） "） " " "体积/μl"9 "2 "2 "4 "2 "1 "0.4 " 温度和时间： 1. 热启动：94 ，5~10min 2. 变性：94 ，45~60s。 3. 退火：50~65 ，1min。退火温度计算：Tm- （5 ~10 ），Tm（解链温度）=4（G+C）+2（A+T）。 4. 延伸：72 ，1~1.5min。 5. 步骤（2）~（4）热循环25~30个周期 6. 保温：延伸72 ，10min 产物检测：凝胶电泳。 实验步骤： （1）设计20μl体系各试剂配比： "试剂 "H2O "Buffer "Mg2+ "dNTPs "P（引物"T（模板"E（酶）" " " " " " "） "） " " "体积/μl"9 "2 "2 "4 "2 "1 "0.4 " （2）按照预先设计的20μl体积配置6管试管量，实际加入量如下表 "试剂 "H2O "Buffer "Mg2+ "dNTPs "P（引物"T（模板"E（酶）" " " " " " "） "） " " "6x加入 "54 "12 "12 "暂不加 "12 "暂不加 "2.4 " "体积/μl" " " "入 " "入 " " 将以上试剂按体积加入EP管中，震荡混匀后离心 （3）完成后分6管加入pcr管中，每管15μl体积，标注1-6号码。 （4）在前1- ~4号PCR管中加入模板DNA，在5号管中加入C3H模板作为阳性参照，6号中不加任何模板D NA，作为阴性参照。 （5）在加完模板的6管试剂中各加入20μl石蜡油 （6）将PCR管放入PCR仪，按之前设定的加热温度与时间设置 a．热启动：94 ，2min；80 ，1min； 此时在各管中加入dNTPs 4μl b．变性：94 ，30s； c．退火：65 ，1.5min； d．延伸：72 ，2min 步骤b~d循环40次 e．保温：72 ，10min （7）完成后用3%琼脂糖凝胶（60ml）电泳进行检测。 实验结果： PCR目标产物约为295bp 琼脂糖凝胶电泳结果如下图所示 1 2 3 4 5 6 Marker 1、2号泳道为 性小鼠DNA模板的PCR产物 3、4号泳道为 性小鼠DNA模板的PCR产物 5号泳道为C3H阳 **PCR实验报告详解** PCR（聚合酶链反应）是一种在体外快速扩增特定DNA序列的技术，对于生物学研究和医学诊断具有重要意义。本实验报告详细记录了PCR实验的步骤、原理以及所需试剂的作用，旨在帮助实验者理解PCR技术的基础操作。 **实验原理：** PCR的基本过程包括变性、退火和延伸三个阶段。通过高温处理双链DNA使其解旋为单链；然后，设计的引物与模板DNA的特定序列结合；DNA聚合酶在引物处开始合成新的DNA链，形成双链DNA。这一过程不断重复，通过多轮循环，目标DNA序列的数量得以迅速增加。 **试剂作用：** 1. **引物**：作为DNA复制的起点，有5'和3'两种，分别与模板DNA的两端互补。 2. **Taq DNA聚合酶**：催化dNTPs与模板DNA结合，形成新链。 3. **Buffer**：如Tris-HCl缓冲液，为酶反应提供最佳条件。 4. **Mg2+**：影响PCR效率，过高或过低都可能导致非特异性扩增或扩增失败。 5. **dNTPs**：作为合成新链的原料，参与DNA复制。 6. **石蜡油**：防止加热过程中DNA溶液的蒸发。 **试剂配置和体积**： 实验中采用20μl的反应体系，具体配比为：9μl水、2μlBuffer、2μlMg2+、4μldNTPs、2μl引物、1μl模板DNA和0.4μlTaq DNA聚合酶。 **温度和时间**： 1. **热启动**：94℃，5-10分钟。 2. **变性**：94℃，45-60秒。 3. **退火**：根据Tm值（5-10℃低于Tm）设定，例如65℃，1分钟。 4. **延伸**：72℃，1-1.5分钟。 5. **循环次数**：25-30次。 6. **保温**：72℃，10分钟。 **实验步骤**： 1. 设计并配置20μl体系的试剂比例。 2. 配置6管PCR反应体系，加入相应试剂。 3. 将试剂加入PCR管中，标记编号。 4. 分别在前四管加入不同模板DNA，第五管作为阳性对照，第六管为空白对照。 5. 各管加入石蜡油，防止蒸发。 6. 按照设定的温度和时间程序进行PCR反应。 7. 使用3%琼脂糖凝胶电泳检测产物。 **实验结果**： PCR目标产物长度约为295bp，电泳结果显示1-4号泳道分别对应♂性和♀性小鼠的DNA模板，5号泳道为阳性参照，6号泳道为空白对照。 PCR实验是一个精细的过程，涉及到精确的温度控制、引物设计和试剂配比。通过优化这些参数，可以高效地扩增特定的DNA序列，为后续的遗传分析或生物研究提供关键数据。