PCR实验报告(1).doc
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普通生物学实验报告 实验名称:用PCR扩增的方法鉴别不同物种来源的肌肉 一、特异性目的片段DNA的扩增 (一)实验原理 聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法,其基本原理为DNA的半保留复 制。PCR技术由 高温变性模板 ; 引物与模板退火; 引物沿模板延伸这3步反应组成一个循环,通过多次循环反应,目 的DNA得以迅速扩增。其主要步骤是:将模板DNA置于高温下(通常为93 - 94 ),使其变性解成单链;人工合成的两个寡核苷酸引物在其合适的复性温度下分别与 目的基因的两条单链互补结合;热稳定DNA聚合酶(Taq酶)在72 将单核苷酸从引物的3' 端开始掺入,以目的基因为模板按5' 3'的方向延伸,合成互补链。 本实验采用物种特异性引物扩增的方法来鉴定3种不同物种来源的肌肉。以不同物种 来源的动物DNA为模板,用物种特异性的引物进行PCR扩增,只有在模板和引物的物种相 对应的情况下才会有特异性条带的出现。应用此方法,可以特异性地检测样品中痕量的 特定DNA成分。 实验步骤 不同反应体系的配制 按下表将各成分分别加入一做好标记的无菌PCR管中,配制50μl的PCR反应体系,注意酶 要最后加,加完后将PCR管放置在冰上。 10×PCR缓冲液 "5μl "5μl "5μl "5μl "5μl "5μl " "dNTP mix(2,5mM each) "4μl "4μl "4μl "4μl "4μl "4μl " "模板 "DNA1 "2μl "2μl " _____ " _____ " _____ " _____ " " "DNA2 " _____ " _____ "2μl "2μl " _____ " _____ " " "DNA3 " _____ " _____ " _____ " _____ "2μl "2μl " "引物 "Pork1 (10μM) "2μl " _____ "2μl " _____ "2μl " _____ " " "Pork2 (10μM) "2μl " _____ "2μl " _____ "2μl " _____ " " "Beef1 (10μM) " _____ "2μl " _____ "2μl " _____ "2μl " " "Beef2 (10μM) " _____ "2μl " _____ "2μl " _____ "2μl " "Taq酶(5U/ μl) "0.25μl "0.25μl "0.25μl "0.25μl "0.25μl "0.25μl " "ddH2O "34.75μl "34.75μl "34.75μl "34.75μl "34.75μl "34.75μl " " 将上述混合液稍加离心,约10s左右。取下后立即置于PCR仪中,盖紧热盖,定好PCR仪的 反应程序,执行扩增程序。 反应程序为: 预变性 94 5min 变 性 94 5s 退 火 50 5s 循环30次 延 伸 72 20s 后延伸 72 5min 3.反应结束后,终止程序,将PCR管取出,放置于4 ,待电泳检测。 二、水平式琼脂糖凝胶电泳法鉴定PCR产物 (一)实验原理 核酸分子是两性解离分子,在高于其等电点的电泳缓冲液(pH 8.0- 8.3)中,其碱基不解离,而磷酸集团全部解离,核酸分子因而带负电荷,电泳时向正极 迁移。琼脂糖主要是从海洋植物琼脂中提取而来并经糖基化修饰,为一种聚合链线性分 子。使用琼脂糖凝胶作为电泳支持介质,发挥分子筛功能,使得大小和构象不同的核酸 分子的迁移率出现较大差异,从而达到分离的目的。 实验步骤 制胶 称取2.4g琼脂糖,放入250ml的锥形瓶中,加入120ml1×TAE缓冲液,微波炉高火加热约4 0s直至沸腾,摇动,使琼脂糖分散,在重复煮沸2次,直至溶液澄清透明。待琼脂糖温度 降到60 左右时,按1:20000的浓度加入Golden View,混匀后倒入已插上合适齿孔梳子的模具中,静置,约30- 45min后凝胶完全凝固。轻轻的垂直拔出梳子,将凝胶取出,放入电泳槽中,添加1×TAE 缓冲液至刚好没过凝胶(有样品孔的一端靠近负极)。 加样 取15μlPCR产物与3μl的6×上样缓冲液混匀,加入到凝胶样品孔中。每加完一个样品应更 换一个吸头。加样前,要记下加样的顺序。在每排样品孔中留出一个位置加入5μl的mar ker。 电泳 加样后的凝胶板立即通电进行电泳,电压100V,样品由负极向正极移动。当溴酚蓝移动 到距离凝胶下缘约1/3时,停止电泳。 拍照 电泳完毕后,取出凝胶,采用凝胶成像系统拍照保存。 实验小结 (一)实验结果 PCR 产物电泳结果 由上图可以看出,样品1和样品6出现了目的条带 (大小约200
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