高通量测序原理.pptx
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高通量测序,也称为下一代测序(NGS),是一种现代生物技术,它极大地提升了DNA测序的速度和规模,从而使得大规模基因组研究成为可能。在这个领域中,Illumina公司的Solexa技术是尤为重要的一个里程碑。下面将详细阐述Solexa测序的基本原理及其特点。 Solexa测序技术起源于两位剑桥大学的化学家的创新理念,它依赖于两个关键概念:“DNA簇”和“可逆性末端终结”。DNA簇是将单个DNA分子通过适配器锚定在芯片上,形成大量紧密聚集的DNA片段,这些簇在后续的测序过程中提供了并行性。每个DNA簇包含约1000个DNA片段,且在100微米平方的区域内可以形成数十万个这样的簇,从而实现大规模的并行测序。 Solexa的测序过程基于“Sequencing-by-Synthesis”(SBS)的概念,这是一个逐步合成DNA的过程。在每个循环中,四种不同的、带有荧光标记的脱氧核糖核苷酸(dNTPs)被加入到反应体系中,其中每个dNTP的3'端都有一个可逆的保护基团。这种设计使得在每次循环中只有一个dNTP能结合到DNA链的3'末端,而不会发生错误的掺入。一旦dNTP掺入,其对应的荧光信号就会被检测到,然后通过化学方法去除保护基团和荧光标记,为下一轮掺入做好准备。这个过程重复进行,直到每个DNA簇的完整序列被读取。 Solexa测序的优点包括高度自动化的工作流程,能够处理大量的小片段测序,例如用于microRNA的表征。此外,其自动化样品制备简单,无需构建文库,降低了实验成本,使测序费用仅为传统方法的百分之一。每个测序芯片有8个通道,可以独立运行或混合多个样品,大大提高了样本使用效率和实验灵活性。一次实验可以读取超过15亿个碱基,这使得对遗传变异、基因表达谱、小RNA鉴定、SNP检测和DNA甲基化分析等广泛应用变得高效且经济。 然而,Solexa技术也存在一些局限性。由于可逆性末端终结反应的效率随循环次数降低,导致信号衰减,使得获得的序列通常较短,这对从头测序(de novo sequencing)和长片段的精确拼接带来了挑战。尽管如此,Solexa测序技术的突破性创新仍为生命科学研究打开了新的大门,推动了诸如精准医学、基因组学和转录组学等领域的发展。
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