PCR 的第一步就是引物设计了。引物设计需要注意的地方很多，在大多数情况
下，我们都是在知道已知模板序列时进行 PCR 扩增的。在某些情况比如构建文
库的时候也会在不知道模板序列的情况下进行设计。这个时候随机核苷酸序列
就与模板不是完全匹配。我们通常指的设计引物都是在已知模板序列的情况下
进行。
设计的目的是在两个目标间取得平衡：扩增特异性和扩增效率。引物分析
软件将试图通过使用每一引物设计变化的预定值在这两个目标间取得平衡。设
计引物有一些需要注意的基本原理：
① 引物长度
一般引物长度为 18~30 碱基。总的说来，决定引物退火温度（Tm 值）最重
要的因素就是引物的长度。有以下公式可以用于粗略计算引物的退火温度。
在引物长度小于 20bp 时：[4(G+C)+2(A+T)]-5℃
在引物长度大于 20bp 时：62.3℃+0.41℃(%G-C)-500/length-5℃
另外有许多软件也可以对退火温度进行计算，其计算原理会各有不同，因
此有时计算出的数值可能会有少量差距。为了优化 PCR 反应，使用确保退火温
度不低于 54℃的最短的引物可获得最好的效率和特异性。
总的说来，每增加一个核苷酸引物特异性提高 4 倍，这样，大多数应用的
最短引物长度为 18 个核苷酸。引物长度的上限并不很重要，主要与反应效率有
关。由于熵的原因，引物越长，它退火结合到靶 DNA 上形成供 DNA 聚合酶结
合的稳定双链模板的速率越小。
② GC 含量
一般引物序列中 G+C 含量一般为 40%~60%，一对引物的 GC 含量和 Tm 值
应该协调。若是引物存在严重的 GC 倾向或 AT 倾向则可以在引物 5’端加适量的
A、T 或 G、C 尾巴。
③ 退火温度
退火温度需要比解链温度低 5℃，如果引物碱基数较少，可以适当提高退
火温度，这样可以使 PCR 的特异性增加；如果碱基数较多，那么可以适当减低
退火温度，是 DNA 双链结合。一对引物的退火温度相差 4℃～6℃不会影响
PCR 的产率，但是理想情况下一对引物的退火温度是一样的，可以在 55℃～
75℃间变化。
④ 避免扩增模板的二级结构区域
选择扩增片段时最好避开模板的二级结构区域。用有关计算机软件可以预
测估计目的片段的稳定二级结构，有助于选择模板。实验表明，待扩区域自由
能（△G）小于 58.6lkJ/mol 时，扩增往往不能成功。若不能避开这一区域时，
用 7-deaza-2’-脱氧 GTP 取代 dGTP 对扩增的成功是有帮助的。
⑤ 与靶 DNA 的错配
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