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三种荧光定量 PCR 检测方法比较
:以参照物为标准,对 PCR 终产物进行分析或对 PCR 过程进行监测,从而达到评估
样本中靶基因的拷贝数,称为定量 PCR 。定量 PCR 的可行性定量一般是在 PCR 扩增的指
数期进行的。
常见检测方法可分为以下几类:
(1) SYBR Green I 检测模式
SYBR Green I 是一种能与双链 DNA 结合发光的荧光染料。其与双链 DNA 结合后,
荧光大大增强。因此, SYBR Green I 的荧光信号强度与双链 DNA 的数量相关,可以根
据荧光信号检测出 PCR 体系存在的双链 DNA 数量。SYBR Green I 的最大吸收波长约
为 497nm ,发射波长最大约为 520nm 。PCR 扩增程序一般为 94℃~55℃~72℃三步法,
40 个循环。SYBR Green I 的缺点:由于 SYBR Green I 没有特异性,不能识别特定的双
链,只要是双链就会结合发光,对 PCR 反应中的非特异性扩增或也会产生荧光,通常本
底较高,所以在临床上使用可能会有假阳性发生。
SYBR Green I 的优点:SYBR Green I 的优点是因为其缺点产生,由于它能所有的双
链 相结合,所以对不同模板不需特别定制不同的特异性探针,通用性较好,并且价格相对
较低。这对科研是很有利的,因此国内外在科研中使用比较普遍。
(2) 水解探针模式(man 探针)
TaqMan 探针是一种探针,荧光基团连接在探针的 5’末端, 而淬灭剂则在 3’末端。
当探针与靶序列配对时,荧光基团发射的荧光因与 3’端的淬灭剂接近而被淬灭。在进行延
伸反应时,聚合酶的 5’外切酶活性将探针切断,使得荧光基团与淬灭剂分离,发射荧光。
一分子的产物生成就伴随着一分子的荧光信号的产生。随着扩增循环数的增加,释放出来的
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