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用软件设计引物（ Primer Premier & Oligo ）
使用不合适的 PCR 引物容易导致实验失败：表现为扩增出目的带之外的多条带（如形成引物二聚体带） ，不出带或出带
很弱，等等。现在 PCR 引物设计大都通过计算机软件进行，软件的立足点也是按照引物设计的基本原则，只是更加快
速和自动化而已。我们可以直接提交模板序列到特定网页，如著名的 primer3 （ http://frodo.wi.mit.edu/ ），得到设计好的引
物， 也可以在本地计算机上运行引物设计专业软件。 一般来说，专门进行 PCR 引物设计的专业软件功能更为强大，但使
用起来却不太容易。
软件的引物设计功能主要体现在两个方面：首先是引物分析评价功能，该功能只有少数商业版软件能够做到，其中以
“ Oligo 6 ”最优秀；其次是引物的自动搜索功能，各种软件在这方面的侧重点不同，因此自动搜索的结果也不尽相同。据
笔者的经验， 自动搜索功能以 “Premier Primer ”为最强且方便使用， “Oligo 6 ”其次，其他软件如 “Vector NTI Suit ”、“DNAsis”、
“ Omiga”和 “ Dnastar ”都带有引物自动搜索功能，但搜索结果不是十分理想。要想得到效果很好的引物，在自动搜索的基
础上还要辅以人工分析。 笔者认为引物设计软件的最佳搭配是 “Oligo ”和 “Premier ”软件合并使用， 以 “Premier ”进行自动搜
索， “Oligo ”进行分析评价，如此可快速设计出成功率很高的引物。
Primer Premier 5.0 的使用技巧简介
1. 功能
“ Premier ”的主要功能分四大块，其中有三种功能比较常用，即引物设计、限制性内切酶位点分析和 DNA 基元 (motif) 查
找。 “Premier ”还具有同源性分析功能，但并非其特长，在此略过。此外，该软件还有一些特殊功能，其中最重要的是设
计简并引物，另外还有序列 “朗读 ”、 DNA 与蛋白序列的互换、语音提示键盘输入等等。
有时需要根据一段氨基酸序列反推到 DNA 来设计引物，由于大多数氨基酸（ 20 种常见结构氨基酸中的 18 种）的遗传
密码不只一种，因此，由氨基酸序列反推 DNA 序列时，会遇到部分碱基的不确定性。这样设计并合成的引物实际上是
多个序列的混和物，它们的序列组成大部分相同，但在某些位点有所变化，称之为简并引物。遗传密码规则因物种或细
胞亚结构的不同而异，比如在线粒体内的遗传密码与细胞核是不一样的。 “Premier ”可以针对模板 DNA 的来源以相应的
遗传密码规则转换 DNA 和氨基酸序列。软件共给出八种生物亚结构的不同遗传密码规则供用户选择，有纤毛虫大核
（ Ciliate Macronuclear ）、无脊椎动物线粒体（ Invertebrate Mitochondrion ）、支原体（ Mycoplasma ）、植物线粒体（ Plant
Mitochondrion ）、原生动物线粒体（ Protozoan Mitochondrion ）、一般标准（ Standard ）、脊椎动物线粒体（ Vertebrate
Mitochondrion ）和酵母线粒体（ Yeast Mitochondrion ）。
2. 使用步骤及技巧
其主要功能在主界面上一目了然。限制性酶切点分析及基元查找功能比较简单，点击该功能按钮后，选择相应的限制性
内切酶或基元（如 -10 序列， -35 序列等），按确定即可。常见的限制性内切酶和基元一般都可以找到。你还可以编辑或
者添加新限制性内切酶或基元。
进行引物设计时，打开 DNA 序列后点击按钮 primer ，出现 “search criteria ”窗口，有多种参数可以调整。搜索目的（ Seach
For）有三种选项， PCR 引物（ PCR Primers ），测序引物（ Sequencing Primers ），杂交探针（ Hybridization Probes ）。搜索
类型 (Search Type) 可选择分别或同时查找上、下游引物（ Sense/Anti-sense Primer ，或 Both ），或者成对查找（ Pairs），或
者分别以适合上、下游引物为主（ Compatible with Sense/Anti-sense Primer ）。另外还可改变选择区域（ Search Ranges），
引物长度（ Primer Length ），选择方式（ Search Mode ），参数选择（ Search Parameters ）等等。使用者可根据自己的需要
设定各项参数。如果没有特殊要求，建议使用默认设置。然后按 search，随之出现的 Search Progress 窗口中显示 Search
Completed 时，再按 OK ，这时搜索结果以表格的形式出现， 有三种显示方式， 上游引物 （ Sense），下游引物 (Anti-sense) ，
成对显示 (Pairs)。默认显示为成对方式，并按优劣次序（ Rating ）排列，满分为 100 ，即各指标基本都能达标。
点击其中一对引物，如第 1#引物，并把上述窗口挪开或退出，显示 “Peimer Premier ”主窗口， 所得结果分三部分，最上
面是图示 PCR 模板及产物位置，中间是所选的上下游引物的一些性质，最下面是四种重要指标的分析，包括发夹结构
（ Hairpin ），二聚体（ Dimer ），错误引发情况（ False Priming ），及上下游引物之间二聚体形成情况（ Cross Dimer ）。当所
分析的引物有这四种结构的形成可能时，按钮由变成，点击该按钮，在左下角的窗口中就会出现该结构的形成情况。一
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