引物设计重点考虑因素、设计技巧及引物设计软件推荐
2008-03-07 16:24
引物设计重点考虑因素、设计技巧及引物设计软件推荐
http://blog.bioon.com/user1/9650/archives/2008/166704.shtml
我最近合成了几十对引物,,在实战中多多少少有些心得,拿出来给大家分享。
我感觉想把引物合成的比较好, 除了前引物和后引物的 Tm不能相差太大,我们
还要重点考虑以下因素:
一、 GC% GC含量
对于 PCR反应来说 GC含量在 40%—60%,一般 50%左右比较合适;而对于测序引
物和杂交探针来说 GC含量至少应为 50%。产物中 GC含量最好大于引物中的 GC
含量。
二、 Degeneracy 多义性
当设计多义引物时应尽量减少引物多义性, 这样会带来更好的特异性, 应尽量避
免 3 末端的多义性,因为这里即使一个碱基的错配都能阻止引物延伸。
三、3’ End Stability 3 末端稳定性
引物稳定性影响它的错配效率,一条理想的引物应该有一个稳定性较强的 5 末
端和相对稳定性较弱的 3 末端。如果引物 3 稳定性强,有可能在即使 5 末端不
配对的情况下造成错配, 形成非特异性扩增条带 (secondary bands) 。而 3 末
端稳定性低的引物较好的原因是在引物发生错配时,由于 3 末端不太稳定引物
结合不稳定而难以延伸。
四、 GC Clamp GC钳
引物与目的位点的有效结合需要有稳定的 5 末端。这一段有较强稳定性的 5 末
端称为 GC钳。它保证引物与模板的稳定结合。选择有合适稳定性的引物能在确
保不产生非特异性条带的前提下尽量降低退火温度。
五、 Secondary Structures 二级结构
二级结构是引物设计中必须考虑的一个重要因素。 二级结构能显著影响反应中能
与模板正确结合的引物数量,发卡结构的存在能限制引物与目的位点的结合能
力,从而降低扩增效率,形成发卡环的引物则不能在 PCR扩增中发挥作用。
六、 Hairpin 发卡结构
发卡结构的形成是由于引物自身的互补碱基分子内配对造成引物折叠形成的二
级结构,并由于发卡结构的形成是分子内的反应 , 仅仅需要三个连续碱基配对就
可以形成。 发卡结构的稳定性可以用自由能衡量。 自由能大小取决于碱基配对释
放的能量以及折叠 DNA形成发卡环所需要的能量,如果自由能值大于 0 则该结
构不稳定从而不会干扰反应,如果自由能值小于 0 则该结构可以干扰反应。
七、 Dimer 二聚体
引物之间的配对区域能形成引物二聚体, 它是相同或不同的两条引物之间形成的
二级结构。 它造成引物二聚体扩增并减少目的扩增产物, 二聚体可以在序列相同
的两条引物或正反向引物之间形成,如果配对区域在 3 末端问题会更为严重, 3
末端配对很容易引起引物二聚体扩增。
八、 False Priming 错配
如果引物可以结合除目的位点外的其他区域, 扩增效率将明显降低目的产物带将